Giáo trình thực hành sinh hóa

http://www.ebook.edu.vn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG













GIÁO TRÌNH
THỰC TẬP SINH HÓA
Mã số môn học: HS 632





Biên soạn:

Tiến sĩ Nguyễn Minh Chơn
Thạc sĩ Phan Thị Bích Trâm
Thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy




NĂM 2005



http://www.ebook.edu.vn

LỜI NÓI ĐẦU
Giáo trình thực tập sinh hóa được biên soạn trên cơ sở kế thừa và phát huy
giáo trình được quí Thầy Cô tiền nhiệm biên soạn trước đây. Giáo trình này còn bổ
sung và sửa đổi nội dung cho phù hợp với chương trình cải cách, phù hợp với điều
kiện hiện tại và hướng phát triển của phòng thí nghiệm trong tương lai. Một số
phương pháp có sử dụng thiết bị phân tích cũng được đưa vào để người đọ
c tham
khảo và có thể ứng dụng được trong tương lai khi điều kiện phòng thí nghiệm được
trang bị tốt hơn. Nội dung giáo trình nhằm giúp cho sinh viên các chuyên ngành
Trồng Trọt, Nông Học, Công Nghệ Thực Phẩm, Thủy Sản, Chăn Nuôi, Môi Trường,
Bảo Vệ Thực Vật, Hoa Viên Cây Kiểng, Khoa Học Đất, Công Nghệ Sinh Học, Cử
Nhân Hóa Học, Sư Phạm Sinh Học, Sư Phạm Hóa Học và các ngành có liên quan hiểu
được các kiến thức cơ
bản trong thí nghiệm sinh hóa và các phương pháp thí nghiệm
để khảo sát carbohydrate (glucid), lipid, amino acid, enzyme, nucleic acid, vitamin, và
các chất khác. Trên cơ sở của các phương pháp phân tích này, các bài thực tập sẽ
được lựa chọn ra cho phù hợp với từng chuyên ngành và điều kiện của từng năm học.
Các bài thực hành còn giúp làm sàng tỏ những vấn đề đã được nêu ra trong phần lý
thuyết.
Nhóm biên soạn xin chân thành biết ơn Cô Phạm Thu Cúc và quí Thầy Cô tiền
nhiệm đã dày công xây dựng giáo trình thực tập tr
ước đây và chúng tôi là những
người tiếp tục phát huy.
Với những điều kiện nhất định của phòng thí nghiệm, những bài thực hành chắc
hẳn chưa đáp ứng hết yêu cầu nghiên cứu sinh hóa hiện đại. Chúng tôi xin chân thành
biết ơn tất cả những ý kiến đóng góp để giáo trình ngày một hoàn thiện hơn.

Thay mặt nhóm biên soạn
Nguyễn Minh Chơn


http://www.ebook.edu.vn

i
MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. NHỮNG KIẾN THỨC CƠ BẢN ..............................................................1
1.1. NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM .............................................................................1
1.2. KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM ........................................................................1
1.2.1. Các điểm cần lưu ý để tránh tai nạn trong khi làm việc và thực tập trong phòng
thí nghiệm..........................................................................................................................1
1.3. KỸ THUẬT SINH HÓA............................................................................................3
1.3.1. Các dụng cụ thường dùng trong thực tập sinh hóa..................................................3
1.3.2. Cách chuẩn bị một dung dịch hóa chất....................................................................7
CHƯƠNG 2. GLUCID......................................................................................................13
2.1. KHÁI QUÁT VỀ GLUCID........................................................................................13
2.2. ĐỊNH TÍNH MONOSACCHARIDE VÀ TINH BỘT ..............................................13
2.2.2. Khảo sát tinh bột......................................................................................................13
2.2.3. Định tính monosaccharide (glucose) và tinh bột.....................................................14
2.3. ĐỊNH LƯỢNG
ĐƯỜNG KHỬ .................................................................................15
2.3.1. Định lượng đường khử theo phương pháp Bertrand...............................................16
2.3.2. Định lượng đường khử theo Hagedorn-Jensen .....................................................18
2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ ...........................................19
2.5. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG SACCHAROSE................................................................20
2.6. ĐỊNH LƯỢNG TINH BỘT VÀ CELLULOSE.........................................................21
2.6.1 Định lượng tinh bột ..................................................................................................21
2.6.2 Định lượng cellulose.................................................................................................22
2.7. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMYLOSE ..................................................................23
CHƯƠNG 3. LIPID...........................................................................................................25
3.1. KHÁI QUÁT VỀ LIPID ............................................................................................25
3.2. KHẢO SÁT TÍNH HÒA TAN CỦA LIPID..............................................................25
3.3. CÁC CHỈ SỐ ĐÁNH GIÁ LIPID..............................................................................25
3.3.1. Xác định chỉ số xà phòng ........................................................................................25
3.3.2. Xác định chỉ s
ố iod..................................................................................................26
3.3.3. Xác định chỉ số acid ................................................................................................27
3.3.4. Xác định chỉ số peroxid...........................................................................................28
3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET.........................29
3.5. XÁC ĐỊNH ACID BÉO BẰNG SẮC KÝ KHÍ.........................................................31
3.6. CHIẾT TÁCH LECITHIN TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG ................................................32
CHƯƠNG 4. KHẢO SÁT VITAMIN ..............................................................................34
http://www.ebook.edu.vn

ii
4.1. KHÁI QUÁT..............................................................................................................34
4.2. ĐỊNH TÍNH VITAMIN D .........................................................................................34
4.3. ĐỊNH TÍNH VITAMIN B1........................................................................................34
4.3.1. Phản ứng tạo thiocrome...........................................................................................34
4.3.2. Phản ứng với thuốc thử Diazo.................................................................................35
4.4. ĐỊNH TÍNH VITAMIN B2........................................................................................36
4.5. ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C ....................................................................................36
4.5.1. Định lượng vitamin C theo phương pháp Muri.......................................................36
4.5.2. Định lượng vitamin C bằng enzyme peroxidase.....................................................39
4.6. XÁC ĐỊNH VITAMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC K

Ý LỎNG CAO ÁP
(HPLC) ..............................................................................................................................39
4.6.1. Phân tích vitamin A và vitamin D...........................................................................39
4.6.2. Phân tích vitamin E .................................................................................................40
4.6.3. Phân tích vitamin K.................................................................................................40
4.6.4. Phân tích acid nicotinic (vitamin B3)......................................................................41
CHƯƠNG 5. KHẢO SÁT AMINO ACID VÀ PROTEIN...............................................42
5.1. KHÁI QUÁT VỀ AMINO ACID VÀ PROTEIN......................................................42
5.2. PHÂN TÍCH HỖN HỢP ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRÊN
GIẤY .................................................................................................................................42
5.3. CÁC PHẢN ỨNG MÀU ĐẶC TRƯNG CỦA PROTEIN........................................44
5.3.1. Phản ứng Biuret.......................................................................................................44
5.3.2. Phản ứng Nynhydrin................................................................................................45
5.4. SỰ KẾT TỦA PROTEIN........................................................................................... 47
5.4.1. Sự kết tủa thuận nghịch ..........................................................................................47
5.4.2. Sự kết tủa bất thuận nghịch .....................................................................................47
5.5. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU...............................48
5.5.1. Khái quát..................................................................................................................48
5.5.2. Định luật Lambert- Beer..........................................................................................49
5.5.3. Ph
ương pháp định lượng protein theo phản ứng biuret...........................................50
5.5.4. Định lượng protein theo phương pháp Lowry.........................................................52
5.6. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL ........53
CHƯƠNG 6. ENZYME....................................................................................................56
6.1. KHÁI QUÁT..............................................................................................................56
6.1. KHÁI QUÁT..............................................................................................................56
6.2. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME AMYLASE TỪ MẦM LÚA.............56
6.2.1. Hệ enzyme amylase.................................................................................................56
http://www.ebook.edu.vn

iii
6.2.2. Sự tạo màu giữa iod với tinh bột và các chuyển hóa của tinh bột khi thuỷ phân
bằng amylase .....................................................................................................................57
6.2.3. Ly trích và khảo sát hoạt tính tương đối của amylase mầm lúa..............................57
6.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên tốc độ thủy giải của amylase...........58
6.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên tốc độ thủy giải của amylase...............................59
6.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế............................................59
6.3. KHẢO SÁT ENZYME UREASE TRONG BỘT ĐẬU NÀNH................................60
6.4. ENZYME HÓA NÂU................................................................................................61
6.4.1. Khái quát về phản ứng hóa nâu...............................................................................61
6.4.2. Khảo sát hoạt tính tương đối của enzyme hóa nâu..................................................64
6.5. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH TƯƠNG ĐỐI CỦA ENZYME β-CYANOALANINE
SYNTHASE .....................................................................................................................65
6.5.1. Trích enzyme CAS ..................................................................................................65
6.5.2. Khảo sát hoạt tính tương đối của enzyme CAS ......................................................65
CHƯƠNG 7. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT ACID NUCLEIC ......................................66
7.1. KHÁI QUÁT..............................................................................................................66
7.2. PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH ACID NUCLEIC .......................................................66
7.2.1. Ly trích ADN từ tế bào vi khuẩn.............................................................................66
7.2.2. Ly trích ARN...........................................................................................................67
7.3. ĐỊNH TÍNH ACID NUCLEIC ..................................................................................68
7.3.1.Tính tan của acid nucleic..........................................................................................68
7.3.2. Các phản ứng màu của acid nucleic........................................................................68
7.4. ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC..............................................................................69
7.4.1. Định lượng ADN ....................................................................................................69
7.4.2. Định lượng ARN .....................................................................................................71
CHƯƠ
NG 8. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁC.............................................73
8.1. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM .....................................................................73
8.2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRO.................................................74
8.2.1. Hàm lượng tro toàn phần.........................................................................................74
8.2.2. Xác định hàm lượng tro hòa tan và không hòa tan trong nước...............................74





http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

1
CHƯƠNG 1.

NHỮNG KIẾN THỨC CƠ BẢN


1.1. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM
1. Mỗi nhóm thực tập phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa
chất và kết quả thí nghiệm cho bài thực tập của mình.
2. Sinh viên phải có mặt ở phòng thí nghiệm đúng giờ qui định: Sáng 7 giờ,
chiều 13 giờ và phải có mặt tại phòng thí nghiệm suốt thời gian thực tập. Sinh viên đến
trễ 10 phút không được vào phòng thí nghiệm. Khi kết thúc thí nghiệm sinh viên phải
báo cáo kế
t quả với giáo viên hướng dẫn trước lúc ra về.
3. Sinh viên vắng mặt phải có giấy phép và phải xin thực tập bù buổi khác.
4. Sinh viên phải xem kỹ bài thực tập trước khi vào phòng thí nghiệm.
5. Mỗi nhóm thực tập cử một sinh viên đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm
tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, bể) báo cáo ngay cho giáo viên hướng dẫn. Sinh
viên phải rửa dụng cụ sạch sẽ trước và sau khi thực tậ
p. Kết thúc buổi thực tập mỗi
nhóm phải lau dọn, làm sạch chỗ nhóm mình làm thí nghiệm, nếu dụng cụ bị mất mát,
hư hỏng phải báo ngay cho người phụ trách phòng thí nghiệm biết.
6. Mỗi buổi thực tập, nhóm trực nhật có nhiệm vụ: nhắc nhở các nhóm dọn vệ
sinh, kiểm tra điện, nước và cửa trước khi ra về.
7. Mỗi nhóm sinh viên làm bài tường trình kết quả theo yêu cầu của từ
ng bài
thực tập, nộp kết quả cho giáo viên hướng dẫn vào buổi thực tập kế tiếp. Kết thúc các
bài thực tập có thi kiểm tra.

1.2. KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM
1.2.1. Các điểm cần lưu ý để tránh tai nạn trong khi làm việc và thực tập trong
phòng thí nghiệm
1. Cẩn thận khi tiến hành thí nghiệm, không được sử dụng những máy móc,
dụng cụ khi chưa biết rõ cách sử dụng. Phải hiểu biết rõ tính ch
ất của các hóa chất để
tránh tai nạn đáng tiếc.
2. Tất cả chai lọ đựng hóa chất đều có nhãn, khi dùng phải đọc kỹ tên và nồng
độ, dùng xong phải đậy đúng nút và để lại đúng chỗ cũ. Phần lớn các hóa chất là độc
nên phải hết sức cẩn thận.
3. Đối với các chất kiềm, acid đậm đặc phải lưu ý:
- Không được hút bằng miệng.
- Phải dùng
ống đong hoặc bình nhỏ giọt.
- Phải đổ acid hoặc kiềm vào nước khi cần pha loãng chúng.
- Phải đặt nghiêng miệng ống nghiệm hoặc cốc về phía không có người.
- Khi acid bị đổ ra ngoài thì cho nhiều nước để làm loãng acid.
4. Khi theo dõi dung dịch đang sôi không được đưa mặt gần hay khi để một
chất lỏng (chất kiềm) vào cốc phải đưa ra xa. Khi đun một chất lỏng trong ống nghiệm
hay cho acid, kiềm vào ph
ải đặt ống nghiệm nghiêng một góc 45
O
. Khi đun phải lắc
đều và hướng miệng ống nghiệm về phía không có người.
5. Khi làm việc với chất dễ cháy thì tuyệt đối:
Khi sử dụng các chất dễ cháy như ether, xăng, benzen, chloroform, natri, kali
cần chú ý:

http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

2
- Không dùng lửa ngọn và tránh xa lửa ngọn.
- Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt (chất dễ cháy, dễ bốc hơi có
thể làm nổ hay bật nút, hơi bốc ra gặp ngọn lửa sẽ cháy, cả khi ngọn lửa ở xa).
- Khi chữa cháy phải bình tĩnh dập tắt ngọn lửa bằng khăn ướt hay bình chửa
cháy.
6. Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh:
- Kiểm tra kỹ d
ụng cụ trước khi dùng.
- Tránh đổ vỡ.
- Dụng cụ nào dùng cho việc đó. Khi đun, chỉ được đun bằng dụng cụ thủy tinh
chịu nhiệt.
- Dụng cụ phải được rửa sạch trước và sau khi sử dụng.
- Không dùng dụng cụ thủy tinh, chai lọ để chứa các chất kiềm mạnh hoặc acid
đậm đặc có tác dụng bề mặt ăn mòn thủy tinh như HF.
7. Khi làm việc vớ
i dụng cụ điện hoặc sử dụng điện tay phải khô, chỗ làm việc
phải khô. Kiểm tra kỹ nguồn điện và dây dẫn điện khi sử dụng.

1.2.2. Sơ cấp cứu trong phòng thí nghiệm
Sơ cấp cứu là biện pháp tạm thời đối với các trường hợp thương tích nhẹ hoặc
trước khi đưa bệnh nhân đến bệnh viện như:

1.2.2.1. Phỏng
a. Phỏng do nhiệt (hay vật nóng)
- Phỏng nhẹ: Lấy vải mùng tẩm dung dịch acid picric bão hòa đắp lên mặt vết
phỏng.
- Phỏng nặng: Đắp nhẹ vải mùng tẩm dung dịch acid picric lên vết phỏng, sau
đó chuyển đi bệnh viện.
b. Phỏng do hóa chất
Việc trước tiên là ngâm vết thương vào chậu nước to hoặc để vết thương dưới
vòi nước chảy thật nhẹ. Sau đó mớ
i trung hòa hóa chất. Chú ý các trường hợp sau:
- Phỏng do acid: Đắp vải mùng tẩm dung dịch bicarbonat natri 8%.
- Phỏng do kiềm: Đắp vải mùng tẩm dung dịch acid picric 3%.

1.2.2.2. Tai nạn về mắt
- Acid hay brom vào mắt: Rửa mắt tức khắc nhiều lần bằng nước sạch, sau đó
tẩm mắt trong dung dịch bicarbonat natri 1%.
- Chất kiềm vào mắt: Xử lý như trên rồi tẩm mắt bằng dung dịch acid boric 1%.

1.2.2.3. Ngộ độc
Khi bị chất
độc vào miệng:
- Acid: Xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch bicarbonat natri 1%.
- Kiềm: Xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch acid 1%.
- Các hóa chất khác: Xúc miệng nhiều lần bằng nước lạnh.
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

3
1.2.2.4. Nhiễm hơi độc
Đưa nạn nhân ra nơi thoáng khí, nới rộng quần áo cho dễ thở. Hô hấp nhân tạo
trong lúc di chuyển đến bệnh viện.

1.2.2.5. Điện giật
Trước hết ngắt mọi cầu dao điện có liên quan đến phòng thí nghiệm. Nới rộng
quần áo nạn nhân sau khi đem ra nơi thoáng. Hô hấp nhân tạo trong khi chờ chuyển
đến bệnh viện nếu là trường hợp nặng.

1.2.2.6. Hỏa hoạn
- Ngọn lửa nhỏ: dập tắt bằng khăn, vải bố ướt hay cát.
- Lửa bắt đầu cháy quần áo: lăn vài vòng dưới đất để dập tắt ngọn lửa, trong khi
các bạn lấy vải ướt trùm lên chỗ cháy và ép sát cho đến khi lửa tắt. Tránh chạy hoảng.
- Dùng bình chửa cháy trước phòng thí nghiệm để dập lửa.
Lưu ý: Sinh viên phải báo ngay cho nhân viên phòng thí nghiệm hoặc giáo viên
hướng dẫn v
ề mọi sự cố trong phòng thí nghiệm.

1.3. KỸ THUẬT SINH HÓA
1.3.1. Các dụng cụ thường dùng trong thực tập sinh hóa
1.3.1.1. Cách rửa các dụng cụ
Độ sạch của các dụng cụ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả thí nghiệm, do đó rửa
dụng cụ hóa học là một phần kỹ thuật phòng thí nghiệm mà sinh viên cần phải biết. Để
chọn phương pháp rửa dụng cụ trong từng trường hợp riêng biệt thường phả
i biết tính
chất của những chất làm bẩn dụng cụ. Sau đó sử dụng tính chất hòa tan của những chất
bẩn này trong nước nóng hay trong nước lạnh, trong dung dịch kiềm, acid, trong các
muối hay các dung môi hữu cơ. Thường dùng cây cọ rửa hoặc dùng bàn chải chà xát
vào các dụng cụ (dùng cây cọ rửa phải chú ý vì ngọn cây cọ có thể làm thủng đáy dụng
cụ).
Các dụng cụ sau khi rửa sạch chất bẩn
được ngâm vào dung dịch sulfo- cromic
(hỗn hợp của K
2
Cr
2
O
7
10% và H
2
SO
4
đậm đặc cùng tỉ lệ thể tích) trong một ngày; sau
đó đem rửa sạch với nước máy và tráng một lần với nước cất, xong để vào tủ sấy khô.
Dụng cụ thủy tinh được gọi là sạch khi nước trên thành không tạo thành những giọt
riêng mà dàn mỏng đều.

1.3.1.2. Các loại dụng cụ và cách sử dụng
a. Ống nghiệm
Ống nghiệm thường là hình trụ có thể tích khác
nhau (Xem hình 1.1). T không được đun nóng ngay tạ
i
đáy ống nghiệm mà ngọn lửa phải được để vào thành
của ống.
Điều kiện khi đun nóng một dung dịch trong ống nghiệm:
- Dung dịch không được nhiều quá 1/3 ống nghiệm.
- Ống nghiệm được giữ nghiêng khoảng 45
O
luôn luôn lắc hoặc khuấy đều.
1
3
Hình 1
Hình1.1. Ống nghiệm
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

4
- Miệng ống nghiệm không được hướng vào một người nào vì nó có thể gây
phỏng.
b. Ống hút (pipet)
Có nhiều loại ống hút thông dụng:
- Loại có bầu an toàn: Dùng để hút những dung dịch độc.
- Loại có hai vạch: Thể tích ghi trên ống là thể tích giữa hai vạch.
- Loại bình thường có phân độ.
Đối với các loại chất lỏng độc, ta dùng một quả bóp cao su đặc biệt gắn vào đầu
ống hút, quả bóp này có thể hút hoặ
c để chất lỏng tự do nhờ một hế thống khóa
(valve).
* Cách sử dụng:
+ Tráng ống hút bằng một lượng nhỏ dung dịch sẽ hút.
+ Hút dung dịch lên đến bên trên vạch ngang. (xem hình 1.2).
+ Lấy ngón trỏ bịt đầu trên ống hút lại (ngón trỏ phải sạch, khô), lau sạch bên
ngoài đầu ống hút bằng giấy thấm.
+ Nâng ống lên cao cho vạch chia độ trên ống hút
ngang tầm mắt, đầu ống dựa vào thành bình rồi cho dung
dị
ch chảy từ từ theo thành bình đến khi đã lấy đủ thể tích
cần dùng cho thí nghiệm thì ngưng (lúc này cần quan sát
mực nước cong tiếp xúc với vạch trên ống hút)
+ Giữ ống hút thẳng đứng rồi chuyển qua bình hứng,
đặt đầu ống hút chạm vào thành bình rồi buông ngón trỏ để
dung dịch chảy tự do (bình hứng phải để hơi nghiêng).
+ Khi dung dịch ngưng không chảy nữa, ta xoay đầu ống hút 2-3 vòng trước khi
lấy
ống hút ra khỏi bình (không thổi vào ống hút để đuổi giọt thừa còn lại trong ống).
+ Khi đọc thể tích cần chú ý đọc theo mặt cầu lõm của chất lỏng không màu
hoặc trong suốt như nước, đọc theo mặt cầu lồi đối với chất lỏng có màu sậm như
dung dịch chứa iod.
c. Micropipet
- Chỉnh thể tích trong khoảng sử dụng của pipet bằng cách vặn nút phía trên đầu
pipet cùng hoặc ngược chi
ều kim đồng hồ cho đến khi các chữ số hiện rõ đúng thể tích
cần dùng.
- Gắn đầu tip lấy hóa chất vào đầu pipet sao cho khít với đầu pipet.
- Giữ pipet thẳng đứng rồi dùng ngón tay cái nhấn nút đến mức vừa cứng tay
đầu tiên. Sau đó cho đầu tip ngập dưới bề mặt dung dịch khoảng 2-3 mm và nhẹ nhàng
buông nút để hút dung dịch. Cẩn thận nhấc pipet ra khỏi dung dịch, chạm nhẹ đầu tip
vào thành dụng cụ
đựng để gạt bỏ dung dịch thừa.
- Bơm dung dịch vào dụng cụ đựng bằng cách nhấn nút tới mức cuối cùng sao
cho không còn dung dịch bám trên thành tip.
* Lưu ý: Cần tráng tip mới vài lần bằng dung dịch sắp hút trước khi lấy hóa
chất, đặc biệt khi dung dịch cần lấy có độ nhớt và tỉ trọng khác với nước.


Hình 2
Hình 1.2. Pipet
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

5
Hçnh 1.6
d. Ống chuẩn độ (Buret)
Được gắn trên giá và có một khóa để điều chỉnh lượng dung dịch chảy ra trên
ống có phân độ. (Hình 1.3).
* Cách sử dụng:
+ Kiểm tra xem khóa đã được bôi vaselin để
tránh chảy nước, hoặc xem có bị quá xít, khó vặn không.
+ Tráng một lần với nước cất và một lần với dung
dịch định dùng để chuẩn độ.
+ Đổ đầy dung dịch vào ống lên đến mức trên số 0.
+ Dùng tay trái m
ở khóa cho dung dịch chảy từ từ
cho đến khi mực dung dịch tiếp xúc với vạch 0 (nếu một
giọt dung dịch còn dính lại đầu ống chuẩn độ thì phải lấy
ra bằng cách chạm vào thành bình chứa).
e. Ống đong (Cylinder)
Có dung tích thay đổi từ 5 mL đến 2 L, có thể có mặt đáy
và được phân độ (hình 1.4), tùy sự phân độ này chỉ gần đúng
nhưng thể tích toàn phần vẫn đúng nhất. Vì thế không nên dùng
ống đong để chia những lượng quá nhỏ (Hình 1.4).
f. Bình tam giác (Erlenmeyer)
Được sử dụng rộng rãi ớ các thí nghiệm phân tích (chuẩn
độ). Bình tam giác có nút mài được gọi là “Bình xác định chỉ số
iod”.
g. Bình chiết
Dùng để tách riêng những dung dịch lỏng không hòa tan
với nhau (ví dụ nước và dầu). Khi lắc bình chiết, ngón tay phải
giữ nút ở đầu trên và khóa ở đầu dưới bình (Hình 1.5).

h. Bình hút ẩm (Desiccator):
Là dụng cụ thủy tinh có thành dày và có nắp, dùng để làm
khô mẫu từ
từ và để bảo quản những chất dễ hút hơi ẩm từ không
khí. (Hình 1.6) Phần dưới của bình có đặt những chất hút ẩm. Muốn
mở nắp bình phải đẩy nắp về một phía, tránh nhắc nắp lên cao.

i. Bình hút chân không:
Được sử dụng khi bơm chân không để lọc. Bình có ống nhánh ở phần trên, ống
nhánh này được nối với bơm chân không (Hình 1.7).

j. Ống sinh hàn:
Là dụng c
ụ để làm lạnh và ngưng hơi (Hình 1.8). Tùy theo
điều kiện mà chất lỏng được tạo thành trong ống sinh hàn khi làm
lạnh hơi hoặc đi sang bình thu hoặc là trở lại bình đun nóng. Sự khác
nhau về chức năng của ống sinh hàn quyết định hình dạng và tên gọi
Hçnh 1.5
Hçnh 1.7
Hình1.8
Hình 3
Hình 1.3. Buret
Hình 1.4. Ống đong
Hình 1.5. Bìnhchiết
Hình 1.6. Bình hút ẩm
Hình 1.7. Bình hút chân không
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

6
của chúng. Khi nối ống sinh hàn cần tuân theo quy tắc: Nước đi vào từ đầu thấp ở phía
dưới và đi ra từ đầu phía trên.





k. Bình định mức:
Là dụng cụ tối cần thiết đối với các thí nghiệm phân tích. Chúng là những bình
cầu đáy bằng có nút thủy tinh mài nhám. Bình định mức dùng để pha loãng một dung
dịch bất kỳ đến một thể tích xác định hoặc để hòa tan một chất nào đó trong một dung
môi với thể tích xác định (hình 1.9).
Khi cho dung dịch vào bình định mức cổ hẹp, phải dùng phễu, xong đậy nắp
chặt và dố
c ngược bình nhiều lần để trộn đều. Khi cho nước gần tới vạch, cẩn thận
dùng ống hút đưa thêm từng giọt đến vạch mức.

1.3.2. Cách chuẩn bị một dung dịch hóa chất
1.3.2.1. Nồng độ của dung dịch
Khi hòa tan muối vào nước ta được nước muối.
+ Muối: chất hòa tan hay dung chất.
+ Nước: dung môi.
+ Nước muối: dung dịch.
Nồng độ của dung dịch có thể đượ
c diễn tả nhiều cách khác nhau:
1. Nồng độ phần trăm khối lượng theo khối lượng (% w/w): Số gam chất hòa
tan có trong 100 gam dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch NH
4
Cl 5% theo khối lượng là trong 100g dung dịch đó có 5g
NH
4
Cl tinh khiết.
2. Nồng độ phần trăm khối lượng theo thể tích (% w/v): Số gam chất hòa tan có
trong 100 mL dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch CuSO
4
10% theo thể tích là trong 100 mL dung dịch đó có
10g CuSO
4
tinh khiết.
3. Nồng độ phần trăm thể tích theo thể tích (% v/v): Là số mL dung chất có
trong 100mL dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch glycerin 10% theo thể tích là trong 100 mL dung dịch đó có
10 mL glycerin nguyên chất.
4. Nồng độ phân tử - nồng độ mol (mol/L hay M): Là số phân tử gam (số mol)
trong 1 L dung dịch.
5. Nồng độ gam/L (g/l): Là số gam chất tan có trong 1 L dung dịch.
Hình 1 9
Hình 1.9. Bình định mức Hình 1.8. Ống sinh hàn
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

7
6. Dung dịch nguyên chuẩn (N): Một dung dịch được gọi là nguyên chuẩn khi 1
L dung dịch ấy chứa một khối lượng chất hòa tan được gọi là đương lượng gam.

1.3.2.2. Cách pha các nồng độ
a. Nồng độ phần trăm theo khối lượng
Thí dụ: Pha 80 gam dung dịch NH
4
Cl 40%.
Dung dịch NH
4
Cl 40% nghĩa là cần có 40g NH
4
Cl cho 100g dung dịch. Vậy
muốn có 80g dung dịch thì cần một lượng NH
4
Cl là:

g32
100
80 x 40
=

Lượng nước phải thêm cho đủ 80g: 80g - 32g = 48g hay 48 mL
Vậy ta cần 32g NH
4
Cl rồi đong 48 mL H
2
O bằng ống đong. Đổ nước vào hòa
tan, được dung dịch NH
4
Cl 40%.
* Trường hợp các hóa chất có ngậm nước (CuSO
4
.5H
2
O, Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O,
NaCO
3
.10H
2
O...) khi cần pha các chất đó ta phải tính tới lượng nước kết tinh trong
chúng.
Ví dụ: Muốn pha 500g dung dịch CuSO
4
20% từ tinh thể ngậm nước (CuSO
4
.
5H
2
O):
Phân tử khối của CuSO
4
khan nước là 160g.
Phân tử khối của CuSO
4
. 5H
2
O là 250g.
Muốn pha 500g dung dịch CuSO
4
20% thì ta cần một lượng CuSO
4
khan nước
là.

20 x 500
100
= 100 g

Muốn có 160g CuSO
4
khan nước ta cần 250g CuSO
4
. 5H
2
O.
Vậy muốn có 100g CuSO
4
khan nước thì phải cần một lượng CuSO
4
. 5H
2
O là:

gam156
160
100 x 250
=

Lượng nước cần đổ thêm: 500g - 156g = 344g
Vậy ta cần 156 g CuSO
4
.5H
2
O và thêm 344 mL nước để hòa tan, ta được 500g
dung dịch CuSO
4
20%.

b. Nồng độ phần trăm khối lượng theo thể tích
Ta hòa tan lượng chất đã cân trong nước và thêm nước tới thể thể tích đúng.
Ví dụ: Cần chuẩn bị 1 L dung dịch NaCl 30% thì ta cần một lượng NaCl là:

gam300
100
1000 x 30
=

Để hòa tan trong nước và thêm nước cho đủ thể tích 1 L.
* Trường hợp các hóa chất có ngậm nước: Khi cần ta phải tính thêm cả lượng
nước trong phân tử như trường hợp trên.
* Trường hợp chất hòa tan là dung dịch: Ta cũng làm tương tự như trên, nghĩa
là cân chất tan và dung môi đem trộn lẫn với nhau cho đều là được. Nhưng việc cân
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

8
chất lỏng không được thuận lợi cho lắm nên cần phải đưa chất lỏng về đơn vị thể tích
cho tiện theo công thức:
V: Thể tích chất lỏng
P: Trọng lượng chất lỏng
d: Tỷ trọng chất lỏng

Mặt khác, đối với chất lỏng thường dùng có giới hạn hòa tan tối đa tính theo %.
Ví dụ: H
2
SO
4
hòa tan tối đa 96%, HCl là 37%, H
3
PO
4
là 65%...
Cho nên khi cân các chất lỏng này phải tính cả số gam có thực trong dung dịch
để pha cho chính xác.
Nếu ta xem HCl là 100% thì khi pha dung dịch 10% ta chỉ cân 10g HCl và thêm
vào 90 mL, trộn đều là được. Nhưng thực ra HCl chỉ có 37% nên trọng lượng cần phải
là:

gx 02,27
37
10 x 100
==

Hay

ml,
1,19
,
722
0227
=

Và ta thêm lượng nước:
100g - 27,02g = 72,98g (hay 72,98 mL)

c. Nồng độ phân tử gam
Mol hoặc phân tử gam là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng
phân tử của nó. Dung dịch phân tử gam là dung dịch chứa 1 phân tử gam chất hòa tan
trong 1 L.
Để chuẩn bị dung dịch 1M của chất nào đó, người ta tính khối lượng phân tử
(được gọi là tổng khối lượng các nguyên tố có trong chất) hoặc tìm trị số của nó trong
bả
ng tra cứu.
Lấy lượng cân chính xác đem hòa tan trong dung môi cho thành 1 L dung dịch
(dùng bình định mức).
Khi phải đun nóng dung dịch, hay khi phản ứng tỏa nhiệt hay thu nhiệt, phải để
cho về nhiệt độ bình thường (20
O
C) rối mới thêm tới vạch. Cũng tương tự như thế,
người ta pha các dung dịch 2-3 M... hay 0,1; 0,01M... bằng cách tính lượng tương ứng
để hòa tan.
Ví dụ: Cần 0,5 L dung dịch K
2
C
2
O
7
0,1M
K
2
C
2
O
7
= 294,2 g
Để chuẩn bị 1 L dung dịch K
2
C
2
O
7
0,1M cần lấy 0,1 phân tử gam nghĩa là
29,42g K
2
C
2
O
7
.
Để chuẩn bị 0,5 L ta chỉ cần 29,42g x 0,5 = 14,71g pha trong bình định mức
500 mL.
+ Trong trường hợp chất rắn có ngậm nước, phân tử gam chất đó phải tính cả
khối lượng các phân tử nước trong chất đó.
+ Đối với chất tan là dung dịch tinh khiết (100%) ta cũng tiến hành cân và pha
như đối với chất rắn không ngậm nước.
d
P
V =
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

9
+ Đối với chất tan là chất lỏng có phần trăm thấp (chưa được 100%) ta phải chú
ý tới nồng độ phần trăm tối đa của chúng để tính toán cho đúng.
Thí dụ: Pha HCl 1M từ HCl 37% (M
HCl
= 36,5) ta phải cân:

gamHCl
x
65,98
37
100365
=

Hay
mlHCl839,82
1,19
65,98
≈=

Vậy ta phải lấy 83 mL HCl 37% để pha thành 1 L là được dung dịch HCl có
nồng độ 1M.
d. Nồng độ đương lượng gam (N)
Dung dịch nguyên chuẩn 1N chứa 1 đương lượng gam chất tan trong 1 L.
Đương lượng gam sẽ được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng từ phương trình phản
ứng dùng trong lúc định phân.
+ Trong sự định phân acid hay base:
Đương lượng gam của acid là khối lượng chất đó có thể cho ra trong phản ứng
1 ion gam H
+
.
Đương lượng gam của một base là khối lượng chất đó có thể cho ra trong phản
ứng 1 ion gam OH
-

Ví dụ:
a. H
+
+ Cl
-
+ Na
+
+ OH
-
Æ Na
+
+ Cl
-
+ H
2
O
1 phân tử gam HCl cho ra 1 ion gam H
+

Vậy đương lượng gam HCl = 1 phân tử gam HCl
b. 2H
+
+ SO
4
2-
+ 2Na
+
+ 2OH
-
→ 2Na
+
+ SO
4
2-
+ 2H
2
O
1 phân tử gam H
2
SO
4
cho ra 2 ion gam H
+
Vậy đương lượng gam H
2
SO
4
= 1/2 phân tử gam H
2
SO
4

c. Một phân tử gam NaOH cho ra 1 ion gam OH
-

Vậy 1 đương lượng gam NaOH = 1 phân tử gam NaOH.
- Một dung dịch nguyên chuẩn HCl chứa 36,5g HCl trong 1 L
- Một dung dịch nguyên chuẩn H
2
SO
4
chứa 98g/2 = 49 gam H
2
SO
4
trong 1 lít.
Con số 1 hay 2 được dùng để chia phân tử gam trong những thí dụ trên được
gọi là hệ số nguyên chuẩn độ.
Trong trường hợp tổng quát số đó được gọi là γ và M/γ được gọi là đương
lượng gam phản ứng.
+ Trong trường hợp phản ứng oxy hóa khử:
Muốn tìm đương lượng của 1 chất trong hệ thống oxy hóa khử, người ta đem
chia phân tử gam cho số điện tử
trao đổi trong phản ứng mà chất đó tham gia.
Thí dụ:
2Na
2
S
2
O
3
+ I
2
Æ Na
2
S
4
O
6
+ 2NaI
I
2
+ 2e Æ 2I
-


−−−
→−
2
64
2
32
222 OSeOS

Số điện tử trao đổi ở phản ứng này là 1. Do đó N=M/1
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

10
Cách pha: việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự như
pha nồng độ phản ứng gam (M) nhưng thay đổi phân tử gam (M) bằng đương lượng
gam (N).

1.3.2.3. Cách xác định lại nồng độ dung dịch
a. Dung dịch chuẩn
Trong quá trình pha hóa chất, có nhiều yều tố làm sai nồng độ như:
+ Việc cân đo không chính xác.
+ Các chất chưa tinh khiết hay hút nước.
+ Để lâu bị thăng hoa hay oxy hóa.
Do người ta ph
ải kiểm tra nồng độ thực của các dung pha dựa vào các chất ổn
định hay nồng độ chính xác được gọi coi là dung dịch chuẩn.
Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải bền vững để nồng độ chất phản ứng
này không thay đổi nhanh chóng với thời gian. Thông thường các thuốc thử chuẩn
là một lượng cân chính xác thuốc thử hoặc dung dịch thuốc thử đúng kín trên ống
thủy tinh, trên có ghi 0,1 hay 0,01 đương lượng gam c
ủa chất đong trong ống.
Khi chuyển hết lượng chất có trong ống thủy tinh vào bình định mức dung tích
1 L rồi pha bằng nước cất tới vạch mức, ta được dung dịch chính xác 0,1 hay 0,01 M.
Trong vài trường hợp, dung dịch chuẩn có thể được làm trực tiếp bằng cách cân
chất rắn và pha loãng dung dịch tới 1 thể tích đúng. Điều này có thể áp dụng với 1 vài
hợp chất bền vững có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO
3
, acid oxalic... Các
chất này được gọi là các chất gốc. Tuy nhiên, đối với những chất khác như NaOH,
HCl và Na
2
S
2
O
3
cách này không thực dụng vì các chất này không có hiệu lực về độ
tinh khiết và dạng cố định để được cân trực tiếp. Ví dụ: NaOH thường bị nhiễm với 1
lượng Na
2
CO
3
thay đổi và rất dễ bị chảy nước, HCl bốc hơi ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm và Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O rã thành bột nó sẽ bị mất nước của tinh thể khi để ngoài
không khí và vì vậy có thành phần không cố định. trong những trường hợp này, điều
cần thiết là pha 1 dung dịch gần đúng nồng độ mong muốn và sau đó định nồng độ
chính xác của nó với 1 dung dịch chuẩn.
b. Cách xác định nồng độ
Trở lại ví dụ phản ứng một acid và một base, phản ứng có thể tóm tắt:
H
+
+ OH
-
Æ H
2
O
1 hóa trị gam acid phản ứng với 1 hóa trị gam base
1 L dung dịch nguyên chuẩn acid sẽ phản ứng trên 1 L dung dịch nguyên chuẩn
base, hai dung dịch nguyên chuẩn sẽ trung hoà với nhau cùng 1 thể tích.
Một cách tổng quát, 2 dung dịch phản ứng với cùng 1 thể tích sẽ có cùng 1
chuẩn độ. Khi 1 thể tích V
1
của dung dịch có chuẩn độ C
1
(C
1
, N) tác dụng lên 1 thể
tích V
2
của dung dịch có chuẩn độ C
2
(C
2
, N) chúng ta có thể viết rằng số hóa trị gam
tác dụng lẫn nhau đều bằng nhau trong 2 trường hợp : C
1
x
V
1
= C
2
x
V
2

Ta sẽ dùng hệ thức này để hiệu chỉnh lại nồng độ 1 số dung dịch chính xác.
Thí dụ: Ta có một dung dịch chuẩn H
2
SO
4
0,1N chính xác. Một dung dịch
NaOH ta pha lấy có nồng độ định pha là 0,1N. Đem chuẩn độ ta thấy 10 mL H
2
SO
4

0,1N tác dụng với 11 mL NaOH ta pha. Vậy nồng độ của dung dịch NaOH ta pha là:

N
x
V
xCV
C 091,0
11
1,010
1
22
1
===

http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

11
Hệ số (10/11 = 0,91) được gọi là hệ số hiệu chỉnh.
Ta cũng có thể áp dụng công thức trên để thay đổi nồng độ của dung dịch từ
đậm đặc sang pha loãng hơn.
Ví dụ:
a. Pha 250mL dung dịch HCl N/5 từ dung dịch HCl 1N
C
1

x
V
1
= C
2

x
V
2

=> N
x
V
1
= N/5
x
250
=> V
1
= 50 mL
Vậy lấy 50 mL dung dịch HCl và thêm nước cho đủ 250 mL ta được dung dịch
HCl N/5.
b. Pha 50 mL ethanol 70% từ ethanol 95%
50 x 70 = V
2
x 95
=> V
2
= 36,9 mL
Vì vậy thêm 13,1 mL nước vào 36,9 mL etanol 96% ta sẽ được 50 mL ethanol
70%.
c. Được thể tích bao nhiêu khi làm loãng 25 mL HCl 0,08N sang HCl 0,05N
C
1

x
V
1
= C
2

x
V
2

0,08
x
25 = 0,05
x
V
2

Ö V
2
= 40 mL

1.3.2.4. Cách pha và định chuẩn một số dung dịch thường dùng
Với điều kiện phòng thực tập sinh hóa hiện nay, chúng ta có thể pha 2 dung
dịch chuẩn gốc sau đây:
a. Dung dịch acid oxalic (COOH)
2
N(γ=2). Cân thật chính xác M/2 lượng
(COOH)
2
để hòa tan với nước cất thành 1 L, ta được dung dịch chuẩn acid oxalic 1N
bảo quản trong chai thủy tinh nút mài và để trong chỗ không ánh sáng.
b. Dung dịch KIO
3
N/10 (γ=6). Cân thật chính xác M/6x10 lượng KIO
3
hòa tan
với nước cất thành 1 lít, ta được dung dịch chuẩn KIO
3
N/10.
Hai dung dịch trên dùng để chuẩn độ lại các dung dịch chúng ta pha sau:
+ Dung dịch NaOH 1N.
Cân 40g NaOH hòa tan thành 1 lít dung dịch với nước cất.
Định lại chuẩn độ NaOH này với dung dịch (COOH)
2
N đã pha trên: lấy 10mL
dung dịch NaOH mới pha chuẩn độ với dung dịch (COOH)
2
N trên với sự hiện diện
của thuốc thử màu phenolphtalein. Nếu dung dịch NaOH này có nồng độ >1N hay
<1N ta phải tính thêm lượng nước hay NaOH thêm vào để được một nồng độ đúng 1N
dùng để định chuẩn các acid sau.
+ Acid nguyên chuẩn N.
Muốn pha các dung dịch nguyên chuẩn từ acid đậm đặc. Nếu chưa biết độ hòa
tan tối đa và tỷ trọng các acid đậm đặc ta xác định độ nguyên chuẩn của nó bằng cách
lấy 1 mL dung dị
ch chuẩn độ với NaOH N đã biết.
Ví dụ: acid đó là 30N ta phải pha loãng 30 lần ít hơn để được acid 1N. Sau đó
hiệu chỉnh lại cho đúng nồng độ 1N với NaOH 1N hay Na
2
CO
3
1N.
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

12
Dung dịch HCl N(HCl đậm đặc 12M =12N, γ=1). Hòa 1000/12 = 85 mL HCl
đậm đặc trong nước cất cho vừa đủ 1 lít. Xác định lại chuẩn độ đúng với NaOH N trên
(dùng thuốc thử màu phenolphtalein).
Từ dung dịch chuẩn HCl 1N, ta áp dụng hệ thức C
1

x
V
1
= C
2

x
V
2
để pha loãng
thành các dung dịch HCl N/2, N/5, N/10, N/20.
Dung dịch H
2
SO
4
1N (H
2
SO
4
đậm đặc 18M = 36N, γ=2). Hòa 1000/36 = 29
mL H
2
SO
4
đậm đặc với nước cất cho đủ 1 L. Để nguội, hiệu chỉnh lại cho đúng
nồng độ 1N với dung dịch NaOH 1N trên (dùng thuốc thử màu phenolphtalein).
Dung dịch permanganat kali (KMnO
4
) N/10 (γ=5). Cân M/5 x 1/10g KMnO4
hòa tan trong nước cất cho đủ 1 lít. Hiệu chỉnh nồng độ theo cách sau: Hút 10 mL
dung dịch (COOH)
2
N/10 + 10 mL dung dịch H
2
SO
4
N/5. Đun nóng khoảng 40
O
C -
50
O
C nhỏ KMnO
4
vừa pha đến màu hồng nhạt.
Dung dịch Na
2
S
2
O
3
N/10 (γ=1). Cân M/1 x 1/10g Na
2
S
2
O
3
hòa tan thành 1lít
với nước cất. Định lại nồng độ với dung dịch KIO
3
N/10 pha ở trên theo cách sau: hút
10 mL dung dịch KIO
3
N/10 thêm vào một ít tinh thể KI+2 mL HCl đậm đặc. Định
chuẩn với dung dịch Na
2
S
2
O
3
vừa pha đến khi hết màu nâu của iod sinh ra (thử với hồ
tinh bột).
Dung dịch iod I
2
N/10 (γ=1). Cân M/1 x 1/10g + 25,5g KI pha thành 1 lít với
nước cất, định phân lại nồng độ với dung dịch Na
2
S
2
O
3
N/10 vừa hiệu chỉnh.
























http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

13
CHƯƠNG 2.

KHẢO SÁT CARBOHYDRATE (GLUCID)

2.1 KHÁI QUÁT VỀ CARBOHYDRATE
Các hợp chất carbohydrate gồm 3 loại:
- Monosaccharide: là đơn vị cấu tạo của carbohydrate, không bị thủy phân.
Ví dụ: Glucose và fructose.
- Oligosaccharide: có từ 2 đến 10 monose gồm: di, tri hay tetrasaccharide
Ví dụ: Saccharose (đường mía), lactose (đường sữa), maltose (đường mạch
nha).
- Polysaccharide: gồm 2 loại:
+ Polysaccharide thuần: gồm những monomer cùng loại.
Ví dụ: tinh bột, cellulose và glycogen.
+ Polysaccharide tạp: Gồm những monomer khác loại hay dẫn suất của
monomer hoặc có thêm chất béo.
Ví dụ: Heparin, acid hyallycoric.

Tính chất
- Monosaccharide: Có tính khử, d
ễ bị mất nước bởi acid vô cơ mạnh (H
2
SO
4
,
HNO
3
đậm đặc) để cho ra dẫn suất furfural. Chất này dễ kết hợp với các loại phenol
(resorcinol, α- naphthol, orcinol...) để cho phản ứng màu.
- Oligosaccharide: Bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme thích hợp để cho ra các
thành phần cấu tạo tương ứng. Trường hợp disaccharide, tùy cách kết hợp các
monomer sẽ có tính khử hay không. Khả năng khử của oligosaccharide yếu hơn
monosaccharide.
Trong cơ thể sinh vật carbohydrate đóng vai trò lớn, nó là thành phần cấu tạo
nên các cơ
quan và dịch gian bào. Nó cung cấp phần lớn năng lượng cho tế bào
sống.

2.2 ĐỊNH TÍNH MONOSACCHARIDE VÀ TINH BỘT
2.2.1 Khảo sát tinh bột
Tinh bột là chất dự trữ của thực vật, là nguồn thức ăn và nguồn cung cấp năng
lượng chính cho người và động vật.
Tinh bột không tan trong nước lạnh. Khi đun nóng với nước thì trương lên và
tạo thành hồ (hồ tinh bột), cho màu xanh (đôi khi màu tím đỏ) với iod, không có tính
khử. Tinh bột b
ị thuỷ phân bởi acid đậm đặc (HCl, H
2
SO
4
).
O
O
CH
2
OH
O
O
CH
2
OH
CH
2
OH
O
O
O
CH
2
OH
O
OH
Âáöu khæí

Cấu tạo một đoạn amylose của tinh bột

http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

14
Chuẩn bị tinh bột
Khoai lang rửa sạch, mài trên bàn mài đặt trên rây đã để sẵn trong chậu thủy
tinh. Mài nhẹ tay cho nhuyễn, xong vắt thật kỹ bã khoai lang với 200 mL nước cất,
chuyển nước bột từ chậu thủy tinh vào cốc 250 mL, để yên cho bột lắng. Khi bột đã
lắng kỹ, gạn bỏ phần nước ở trên rồi tiếp tục cho nước cất vào khuấy đều, để l
ắng tiếp
tục rồi lại gạn bỏ phần nước trên. Lặp lại vài lần cho đến khi tinh bột trắng và sạch.
Khuấy tinh bột với vài mL nước cất rồi cho vào 100 mL nước cất đang sôi thì ta được
dung dịch hồ tinh bột.
Lấy dung dịch hồ tinh bột vừa nhận được để làm các thí nghiệm sau.
Tiến hành
a. Cho màu với iod
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 5 mL dung dịch hồ tinh bột, cho tiếp 2 gi
ọt
iod. Nhận xét kết quả. Sau đó xem ống nghiệm đun cách thủy khoảng 5 phút - Nhận
xét. Để nguội - Quan sát, nhận xét và giải thích.
b. Phản ứng thủy phân
Tiến hành: Dùng ống nghiệm lớn cho vào 15 mL dung dịch hồ tinh bột. Cho
tiếp vào 5 mL HCl đậm đặc, khuấy đều. Đun cách thủy, cứ sau 1 phút lấy 1 giọt dung
dịch đang thủy phân nhỏ lên 1 giọt iod đã để sẵn trên đĩa kính đồng hồ. Thử như
vậy
cho đến khi không cho màu với iod. Nhận xét màu thay đổi khi thử dung dịch thủy
phân với iod. Kết luận.
Lưu ý: Giữ dung dịch đã thủy phân để làm các phản ứng sau.

2.2.2 Định tính monosaccharide (glucose) và tinh bột
a. Phản ứng Molish
Nguyên tắc: Các loại carbohydrate đều cho phức màu tím với dung dịch α-
naphthol trong acid H
2
SO
4
đậm đặc.
O
CH
2
OH
H
2
SO
4
ââ
-3H
2
O
HOCH
2
CHO
O
furfural


5-hydroxymethyl furfural
α Napthol
O
HOCH
2
CHO
OH
CH
OH
C
O
CH
C
CH
2
OH
CH
+ 2
- H
2
O
OH

Phức màu tím
α-D-glucose
5-hydroxymethyl furfural
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

15
Tiến hành
Chuẩn bị các ống nghiệm theo bảng sau:
Ống nghiệm

Hoá chất
1
Glucose 1%
2
Hồ tinh bột 1%
3
Hồ tinh bột thủy phân
Dung dịch 2 mL 2 mL 2 mL
Thuốc thử Molish 3 giọt 3 giọt 3 giọt
H
2
SO
4
đậm đặc Kỹ thuật: cho từ từ thành dòng chảy liên tục theo thành
ống nghiệm, không lắc, đến khi xuất hiện màu tím thì
dừng lại, đọc thể tích dung dịch acid đã dùng.
Nhận xét tốc độ phản ứng của mỗi ống nghiệm. Giải thích và nêu ý nghĩa của
phản ứng Molish.
b. Phản ứng với thuốc thử Fehling
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm đun nóng, monosaccharide ở dạng enol-
diol không bền, dễ dàng khử các kim loại nặng như Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. Monosaccharide
sẽ khử đồng II trong dung dịch Fehling thành đồng I có kết tủa đỏ gạch. Các
disaccharide có nhóm -OH glycoside tự do đều có tính khử:
(HCOH)
n
CHO
CH
2
OH
OCH
CHO
Cu
COOK
COONa
+
(HCOH)
n
CH
2
OH
COOH
H O CH COONa
COOKCHOH
+
+
Cu
2
O
âoí gaûch

Tiến hành
Ống nghiệm
Hoá chất
1 2 3
Glucose 1% 2 mL 0 0
Tinh bột thuỷ phân (phải trung hoà) 0 2 mL 0
Tinh bột khoai lang 0 0 2mL
Fehling (A+B tỉ lệ 1:1) 3 mL 3 mL 3 mL
Đun cách thủy 3 ống nghiệm trong khoảng từ 3- 5 phút. Quan sát hiện tượng
xảy ra ở 3 ống nghiệm, giải thích và viết phương trình phản ứng.

2.3 ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ
Các phương pháp hóa học xác định đường khử đều dựa trên khả năng khử các
hợp chất khác nhau của chúng. Trong thực tế có rất nhiều phương pháp để xác định,
tùy thuộc vào hàm lượng nhiều hay ít người ta có thể sử d
ụng một trong các phương
pháp thông dụng sau đây:



http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

16
2.3.1 Định lượng đường khử theo phương pháp Bertrand
Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose, maltose...) dễ dàng
khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng I oxyt có màu đỏ gạch,
có khả năng khử với muối Fe
3+
thành muối Fe
2+
trong môi trường acid:
Cu
2
O + Fe
2
(SO
4
)
3
+ H
2
SO
4
→ 2CuSO
4
+ 2FeSO
4
+ H
2
O
Fe
2+
sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO
4
là chất oxy hóa nên dùng
KMnO
4
để chuẩn độ Fe
2+
trong môi trường acid:
10FeSO
4
+ 2KMnO
4
+ 8H
2
SO
4
→ K
2
SO
4


+ 2MnSO
4
+ 5Fe
2
(SO
4
)
3
+ 8 H
2
O


Dựa vào lượng KMnO
4
sử dụng ta có thể tính được lượng Cu
2
O và từ đó tính
được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch
KMnO
4
và đường khử của Bertrand.
Hóa chất
- Thuốc thử Fehling = Fehling A+Fehling B tỉ lệ 1:1
- Fehling A: 40 g CuSO
4
.5H
2
O trong 1 lít nước cất
- Fehling B: 20g natri kali tartrate (C
4
H
4
O
6
NaK.4H
2
O) và 150g NaOH trong 1
lít nước cất.
- Dung dịch Fe
2
(SO
4
)
3
trong H
2
SO
4
: 50g Fe
2
(SO
4
)
3
và 20g H
2
SO
4
thêm nước
đến 1 lít.
- Dung dịch KMnO
4
1/30N.
- Dung dịch acetate chì 30%
- Dung dịch Na
2
SO
4
bão hoà
Tiến hành
Chuẩn bị nguyên liệu
Cân và cho vào cối sứ 5-10 gram nguyên liệu tươi, nghiền nhỏ, thêm khoảng
50ml nước cất vào bình tam giác 250 ml. Đem đun cách thủy ở 80
o
C trong 15 phút,
thỉnh thoảng lắc đều trong khi đun để chiết tách đường. Sau đó lấy ra, để nguội đến
nhiệt độ phòng.
Tiến hành khử tạp chất bằng cách:
+ Thêm 7 mL dung dịch acetate chì 30% vào dịch chiết đường cho vào bình
định mức 100mL, lắc đều và để lắng 5 phút. Nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng
trong suốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong.
+Cho ti
ếp 20 mL dung dịch Na
2
SO
4
bão hoà vào để loại chì thừa. Lắc đều và để
tủa lắng xuống.
+Thêm nước cất vừa đủ đến vạch 100 mL, lắc đều và lọc qua giấy lọc khô.
Dịch lọc dùng để tiến hành định lượng.
Tiến hành định lượng
Cho 10 mL dung dịch đường cần khảo sát và 10mL thuốc thử Fehling vào bình
tam giác 250 mL. Đậy bình bằng nút thủy tinh và đun trên bếp có lưới amiăng. Đun
sôi khoảng 3 phút, kết tủa đỏ
xuất hịên trong bình. Lấy bình ra để nguội.
Rửa kết tủa vài lần với nước ấm đã đun sôi cho đến khi dịch rửa không còn
phản ứng kiềm trên giấy quỳ. Quá trình rửa được tiến hành trên phễu lọc chân không
với giấy lọc xốp G4 và chú ý là phần lớn kết tủa trên phễu lọc và trong bình luôn được
phủ một lớp nước để Cu
2
O không bị oxy hóa bởi oxy không khí.
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

17
Hòa tan kết tủa Cu
2
O vào bình tam giác bằng cách cho từ từ khoảng 5mL dung
dịch Fe
2
(SO
4
)
3
trong H
2
SO
4
và dùng đũa thủy tinh khuấy thật cẩn thận để hòa tan hoàn
tòan kết tủa trên phễu. Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước nóng cho
vào bình tam giác 100mL.
Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO
4
1/30N cho đến khi xuất hiện màu
hồng nhạt bền trong 20-30 giây.
Từ lượng KMnO
4
1/30N dùng để chuẩn độ, tra bảng 2.1 để suy ra lượng đường
có trong mẫu phân tích. Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung
dịch đường bằng nước cất.
Tính kết quả
Hàm lượng đường khử tính theo công thức:

X =
a
xx
100
1000m
V
V
1
xx

trong đó :
X: hàm lượng đường khử tính theo %
a: số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số mL KMnO
4
0,1N dùng để
chuẩn độ mẫu phân tích trừ đi số mL KMnO
4
1/30N dùng để chuẩn độ mẫu không.
V: thể tích pha loãng mẫu (100mL)
V
1
: thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử
m: lượng mẫu đem phân tích
1000: hệ số đổi gam thành mg
Bảng 2.1. Tỉ lệ giữa KMnO
4
1/30N và lượng đường khử
KMnO
4
1/30N(mL) Glucose(mg) KMnO
4
1/30N(mL) Glucose(mg)
0.2 0,01819,2
1 0,81920,3
2 1,82021,5
3 2,82122,7
4 3,92223,8
5 5,02325,3
6 6,12426,2
7 7,22527,4
8 8,32628,6
9 9,32729,9
10 10,428 31,2
11 11,529 32,5
12 12,630 33,8
13 13,731 35,1
14 14,832 36,3
15 15,933 37,6
16 17,034 38,9
17 18,135 40,2

http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

18
2.3.2. Định lượng đường khử theo Hagedorn-Jensen (bổ túc bởi Isskuts và Both)
Nguyên tắc: Dựa vào tính khử của monosaccharide, định lượng glucose theo
phản ứng oxy hóa - khử. Glucose là chất khử; fericyanua kali là chất oxy hóa. Phản
ứng xảy ra trong môi trường kiềm đun nóng.
2K
3
Fe(CN)
6
(HC OH)
n
CH
2
OH
CHO
3Na
2
CO
3
H
2
O
+++
++
(HC OH)
n
CH
2
OH
COONa
3NaHCO
3
2K
3
NaFe(CN)
6

Glucose sẽ khử một phần fericyannua kali. Đây là phản ứng thuận nghịch, để
phản ứng xảy ra một chiều, ferocyanua kali được làm kết tủa dạng hóa hợp kẽm không
tan:
2K
3
NaFe(CN)
6
+ 2ZnSO
4
Æ 2K
2
ZnFe(CN)
6
↓ + Na
2
SO
4
+ K
2
SO
4
(2)
Phần fericyanua kali thừa được định phân gián tiếp qua phương pháp định phân
iod bằng thiosulfit natri (Na
2
S
2
O
3
)
K
3
Fe(CN)
6
+ KI Æ K
4
Fe(CN)
6
↓ + 1/2I
2
(3)
2Na
2
S
2
O
3
+ I
2
Æ Na
2
S
4
O
6
+ 2NaI (4)
Tiến hành
+ Dùng dung dịch glucose có nồng độ biết trước 2 mg/mL pha thành 5 dung
dịch có nồng độ khác nhau từ 0,4 mg/mL đến 2 mg/mL theo bảng sau:

Lưu ý: Nên kết hợp cho nước cất một lần để tránh sai số. Ví dụ: ống 1 cho thêm 15mL
nước cất, ống 2 cho 16 mL, ống 3 cho 17 mL...
+ Đun cách thủy các ống nghiệm trên 30 phút
+ Đun xong để nguội (có thể làm lạnh) rồi thêm vào mỗi ống 10 mL ZnSO
4
.KI
+ Quan sát màu ở mỗi ống nghiệm (không được khuấy)
+ Ghi nhận xét, giải thích và kết luận.
Chuẩn bị định phân
+ Rửa sạch buret bằng nước cất, tráng qua bằng Na
2
S
2
O
3
0,02 N. Cho tiếp
Na
2
S
2
O
3
0,02 N đến vạch 0 rồi bắt đầu định phân.
Ống nghiệm
Hoá chất
1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ dung dịch glucose (mg/mL)
Thể tích dung dịch glucose 2 mg/mL (mL)
Thể tích dung dịch glucose định phân Xmg/mL
Thể tích nước cất (mL)
2
5
0
0
1,6
4
0
1
1,2
3
0
2
0,8
2
0
3
0,4
1
0
4
X
0
5
0
0
0
0
5
Pha loãng bằng nước cất (mL)
Fericianua kali K
3
Fe(CN)
6
0,02N (mL)
15
10
15
10
15
10
15
10
15
10
15
10
15
10
(1)
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

19
+ Định phân mẫu đối chứng trước (ống 7), chuyển dung dịch trong ống qua cốc
250 mL. Cho vào ống nghiệm đó 10 mL CH
3
COOH 9% tráng ống nghiệm rồi đổ
chung vào cốc 250 mL.
Quan sát hiện tượng, giải thích, viết phương trình phản ứng xảy ra.
+ Cách định phân: cho Na
2
S
2
O
3
0,02N ở buret xuống cốc từ từ và lắc nhẹ cốc
cho đến khi dung dịch chuyển thành màu vàng rơm rất lợt. Thêm vào đó 1-2 giọt hồ
tinh bột, dung dịch trong cốc chuyển sang màu xanh, cho tiếp Na
2
S
2
O
3
0,02N từ từ
từng giọt một cho đến khi màu xanh đột ngột biến mất và trở thành màu trắng sữa đục
là được. Ghi nhận thể tích Na
2
S
2
O
3
0,02N trên buret.
+ Tiếp tục định phân từ ống nghiệm 1 đến ống nghiệm 6, tương tự như trên.
Lưu ý: - Khi định phân cho dung dịch Na
2
S
2
O
3
0,02N chảy từ từ và lắc đều.
- Theo dõi dung dịch trong cốc định phân đến màu vàng rơm rất lợt, nếu
không sẽ bị sai số nhiều.
+ Kết quả định phân lập bảng:
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ dd glucose (mg/mL) 2 1,6 1,2 0,8 0,4 X 0
Thể tích dd Na
2
S
2
O
3
0,02N V
1
= V
2
= V
3
= V
4
= V
5
= V
6
= V
0
=
∆V=V
0
-V
i
(mL) ∆V
1
= ∆V
2
= ∆V
3
= ∆V
4
= ∆V
5
= ∆V
6
=
0
Vẽ đường biểu diễn ∆V = f(C) mg/mL
Đường biển diễn có dạng y = ax.
+ Dựa vào đồ thị, suy ra nồng độ glucose định phân (tức nồng độ dung dịch
trong ống 6)

2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ
Sự định phân này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho đường và nhiều
chất hữu cơ với sự hiện diện của acid sulfuric (H
2
SO
4
). Sự chính xác của kết quả này
tùy thuộc vào:
+ Độ sạch các dụng cụ.
+ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H
2
SO
4

+ Nhiệt độ phải cố định trong thời gian đun
Hóa chất
- Alcol 90
o
, 80
o

- Phenol 5%
- H
2
SO
4
đậm đặc
- Saccharose 0,1%
Tiến hành
Cách trích đường
Lấy 1-2 gam nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5-50 mg đường (cân
bằng cân phân tích) cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10 ml alcol 90
O
vào (nếu
dùng nguyên liệu khô thì cần lấy ít mẫu hơn). Sau đó để cốc đun trên nồi cách thủy
cho sôi 3 lần. Khuấy đều bằng đũa thủy tinh, sau khi để nguội lọc không tro (khi lọc
chỉ nên gạn lấy phần alcol) đừng để cặn đổ trên lọc.
http://www.ebook.edu.vn
Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa

20
Sau đó lại cho 10ml alcol 80
O
vào cốc đựng bã, khuấy đều đun 2 lần tới sôi
trong nồi cách thủy. Để nguội lại lọc tiếp. Chiết rút như vậy khoảng 3 lần, xong đưa bã
lên lọc và rửa sạch 2-3 lần bằng alcol 80
O
nóng (rửa từng ít một), alcol qua lọc được
bay hơi ở trong phòng hoặc nồi cách thủy. Đun nhẹ sau khi cho bay hơi alcol, mẫu có
thể để lâu trong bình hút ẩm.
Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất (dùng bình định
mức). Nếu có cặn thì để lắng xuống. Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có thể pha
loãng thêm 5-10 lần tùy theo nồng độ đường nhiều hay ít.
Sau đó có thể tạo phản ứng màu của dung dịch đường theo ph
ương pháp sau:
Dùng Phenol
Hút 1ml dung dịch đường có khoảng 10-70µg đường cho vào ống nghiệm rồi
cho thêm 1ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho vào ống nghiệm 5ml H
2
SO
4
đậm đặc.
Tuyệt đối không để vây acid vào thành ống nghiệm. Để nguội 10 phút rồi lắc và giữ
trên nồi cách thủy 20 phút ở 30
O
C để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ, đem
đo độ hấp thụ ở bước sóng 490nm.
Xây dựng đồ thị chuẩn
Pha dung dịch saccharose gốc nồng độ 100 µg/mL.
Từ dung dịch gốc, pha dãy dung dịch có nồng độ từ 0- 70µg/mL. Thêm các hoá
chất vào 8 ống nghiệm theo bảng sau:
Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6 7 8
Nồng độ dung dịch saccharose
(
µ
g/mL)
0 10 20 30 40 50 60 70
Thể tích dung dịch saccharose gốc
(
µ
L)
0 100 200 300 400 500 600 700
Thể tích nước cất (
µ
L)
1000
900 800 700 600 500 400 300
Thể tích dung dịch phenol 5% (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1
H
2
SO
4
đậm đặc (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5
Để nguội các ống nghiệm 10 phút, lắc đều. Đem đun cách thủy 20 phút ở 30
O
C
để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng
490nm.
Vẽ đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ saccharose rồi tính hàm lượng
đường tổng số có trong mẫu theo công thức sau:
Hàm lượng đường tổng số % = X x V x 100/m
X: nồng độ saccharose được suy ra từ đồ thị chuẩn (µg/mL)
V: thể tích pha loãng sau khi ly trích mẫu.
m: khối lượng mẫu
đem phân tích.
Độ chính xác của phương pháp này là ± 2%

2.5. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG SACCHAROSE
Đường saccharose cùng với một số đường khử có nhiều trong các loại trái cây,
rau, củ... Saccharose không có tính khử nên không thể xác định trực tiếp bằng các
phương pháp Bertrand. Để có thể xác định được saccharose bằng phương pháp này
phải thủy phân nó thành các đường khử glucose và fructose.