XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY GIỐNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE

Xem bản đầy đủ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & DẦU KHÍ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
---------------o0o---------------
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY NẤM MỐC SINH TỔNG HP ENZYME
PECTINASE
GVHD : TS. Lê Văn Việt Mẫn
SVTH : Vũ Thò Hồng Vân
MSSV : 60103229
Tp HCM, tháng 12/2005
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin chân thành cảm ơn Bố, Mẹ và gia đình đã giúp đỡ con
về mọi mặt từ vật chất đến tinh thần để con có thể hoàn thành tốt bài luận văn tốt
nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường ĐHBK – TpHCM, cảm ơn
quý thầy cô, cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em
trong suốt những năm học vừa qua.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy Lê Văn Việt Mẫn
là giáo viên hướng dẫn và tập thể thầy cô bộ môn Công nghệ thực phẩm trường
ĐH Bách Khoa đã chỉ dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt
nghiệp này.
Mình cũng cảm ơn các bạn trong nhóm Châu, Tùng, Song, Đức, các bạn
phòng 101 và các em đã luôn giúp đỡ và động viên mình.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn và chúc mọi người nhiều sức khỏe
và thành công.

Tp.HCM, tháng 1/2006
VŨ THỊ HỒNG VÂN
Luận văn tốt nghiệp
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Tên đề tài “Xác đònh thành phần môi trường nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp
enzyme pectinase”
Pectinase là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân pectin. Chế phẩm
pectinase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, nhất
là trong công nghiệp sản xuất các loại nước ép trái cây. Hiện nay, các chế phẩm
enzyme được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật, trong đó phương pháp nuôi cấy bề
sâu có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp khác. Phương pháp bề sâu cho phép
điều khiển chính xác các thông số kỹ thuật của quá trình lên men và thúc đẩy quá
trình sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật.
Trong luận văn tốt nghiệp này, nội dung nghiên cứu của chúng tôi gồm có
những phần sau:
 Nuôi cấy 3 loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus có khả năng tổng hợp
enzyme pectinase bằng phương pháp nuôi cấy bề sâu: từ kết quả thực nghiệm thu
được, chúng tôi tuyển chọn loài A. awamori có khả năng tổng hợp pectinase cao
nhất để nghiên cứu tiếp.
 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ lên quá trình sinh tổng
hợp pectinase của nấm mốc.
 Tối ưu hóa hàm lượng cơ chất carbon và nitơ trong môi trường nuôi cấy
bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
 Thử ứng dụng chế phẩm enzyme pectinase thô thu được để làm giảm độ
nhớt nước ổi ép.
-iii-
Luận văn tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên hoạt tính enzyme pectinase.
Bảng 2.2: Nồng độ các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật phát triển.
Bảng 2.3: Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi
cấy bề sâu.
Bảng 3.1: Thực hiện phản ứng giữa pectinase và cơ chất.
Bảng 3.2: Dựng đường chuẩn monogalacturonic acid.
Bảng 3.3: Xây dựng đường chuẩn Tyrosin.
Bảng 4.1: Sự thay đổi hoạt tính endo-polygalacturonase trong canh trường nuôi
cấy nấm mốc theo thời gian.
Bảng 4.2: Sự thay đổi hoạt tính exo-polygalacturonase trong canh trường nuôi
cấy nấm mốc theo thời gian.
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính endo-
polygalacturonase trong môi trường nuôi cấy A. awamori.
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính endo-polygalacturonase
trong môi trường nuôi cấy A. awamori.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của hàm lượng NH
4
Cl trong môi trường nuôi cấy đến
hoạt tính endo-polygalacturonase.
Bảng 4.6: Thành phần môi trường của các mẫu thí nghiệm quy hoạch thực
nghiệm.
Bảng 4.7: Hoạt tính của endo-polygalacturonase trong các mẫu trong thí
nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp trực giao bậc hai.
Bảng 4.8: Các hệ số của phương trình hồi quy.
Bảng 4.9: Thể tích dòch ổi ép và dòch enzyme sử dụng.
Bảng 4.10: Thời gian chảy của dòch ổi ép khi bổ sung enzyme và khi không bổ
sung enzyme.
-iv-
Luận văn tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Phân tử pectin.
Hình 2.2: Cơ chế tác dụng của exo-polygalacturonase .
Hình 2.3: Cơ chế tác dụng của endo-polygalacturonase .
Hình 2.4: Cơ chế tác dụng của enzyme pectinesterase.
Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của enzyme pectate lyase.
Hình 2.6: Cơ chế tác dụng của enzyme pectin lyase.
Hình 2.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến hoạt
tính enzyme polygalacturonase.
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu.
Hình 4.1: Sự thay đổi hoạt tính endo-polygalacturonase trong canh trường nuôi
cấy nấm mốc theo thời gian.
Hình 4.2: Sự thay đổi hoạt tính exo-polygalacturonase trong canh trường nuôi
cấy nấm mốc theo thời gian.
Hình 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính endo-
polygalacturonase.
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính endo-polygalacturonase
trong môi trường nuôi cấy A. awamori.
Hình 4.5: Ảnh hưởng của hàm lượng NH
4
Cl trong môi trường nuôi cấy đến
hoạt tính endo-polygalacturonase.
Hình 4.6: Đồ thò biểu diễn phương trình hồi quy.
-v-
Luận văn tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU:.................................................................................................................................2
Lời mở đầu..............................................................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................4
Pectin:[7,8]....................................................................................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc:........................................................................................................................................4
1.1.2. Cấu tạo của pectin:...........................................................................................................................4
Phân tử pectin...........................................................................................................................5
1.1.3. Một số tính chất của pectin:...........................................................................................................5
1.1.4. Phân loại pectin:.................................................................................................................................5
1.2. Enzyme pectinase:[2,3,5,8,9]..................................................................................................6
1.2.1. Phân loại enzyme pectinase:..............................................................................................................6
Cơ chế tác dụng của exo-polygalacturonase........................................................................7
Cơ chế tác dụng của endo-polygalacturonase.....................................................................8
Cơ chế tác dụng của enzyme pectinesterase........................................................................9
Cơ chế tác dụng của enzyme pectatelyase............................................................................9
Cơ chế tác dụng của enzyme pectinlyase...........................................................................10
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase ở vi sinh vật:......10
1.2.3. Phương pháp thu nhận enzyme pectinase:[2, 4]..............................................................................14
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến hoạt tính
enzyme polygalacturonase sinh tổng hợp từ A. oryzae [15] ..................................................18
1.2.4. Ứng dụng của chế phẩm enzyme pectinase:[2]........................................................................19
1.3. Đặc điểm của một số loài nấm mốc trong sinh tổng hợp enzyme pectinase:[7]
21
1.3.1. Aspergillus niger:................................................................................................................................21
1.3.2. Aspergillus oryzae:.............................................................................................................................22
1.3.3. Aspergillus awamori:..........................................................................................................................22
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:...............24
Nguyên liệu:.............................................................................................................................24
1.3.4. Vi sinh vật sử dụng để thu nhận enzyme pectinase:...................................................................24
1.3.5. Hóa chất:.........................................................................................................................................24
1.3.6. Môi trường để giữ giống:...................................................................................................24
1.3.7. Môi trường cơ bản để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp enzyme pectinase:....................25
1.4. Phương pháp nghiên cứu:...............................................................................................26
Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm:...........................................................................................................26
Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu:............................................................................................................27
1.5. Phương pháp phân tích:...................................................................................................30
1.5.1. Cách xác đònh hoạt tính enzyme pectinase:..................................................................................30
2. Chương 4: Kết quả và bàn luận:..................................................................................38
2.1. Khảo sát chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp pectinase có hoạt tính cao nhất:
38
2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến hoạt tính pectinase:..................................42
-vi-
Luận văn tốt nghiệp
2.3. Chọn nguồn Nitơ vô cơ cho môi trường nuôi cấy:..................................................44
2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ lên hoạt tính pectinase:.......................................46
2.5. Quy hoạch thực nghiệm:...................................................................................................48
2.5.1. Thực hiện:........................................................................................................................................48
2.5.2. Kết quả: ..........................................................................................................................................49
2.6. Thử ứng dụng chế phẩm pectinase thô thu được để làm giảm độ nhớt của
dòch quả: .....................................................................................................................................54
3. Kết luận và đề nghò:.......................................................................................................57
3.1. Kết luận:............................................................................................................................57
3.2. Đề nghò:...............................................................................................................................57
4. TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................59
5. PHỤ LỤC..............................................................................................................................61
-vii-
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Luận văn tốt nghiệp
-1-
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Luận văn tốt nghiệp
MỞ ĐẦU:
Lời mở đầu
Trong vòng vài chục năm gần đây, công nghiệp sản xuất chế phẩm enzyme
đã có những bước tiến khổng lồ với tốc độ phát triển khá mạnh mẽ. Các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều về số lượng, đa dạng về chủng loại. Vì
enzyme là những chất không thể tổng hợp bằng con đường hóa học nên người ta
chỉ thu chúng từ các nguồn sinh học. Ta có thể thu nhận enzyme từ động vật, thực
vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hầu hết các nguồn nguyên liệu động vật, thực vật
không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzyme với quy mô công
nghiệp lớn. Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa hẹn vì enzyme từ vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng
nhanh và có hoạt lực xúc tác mạnh mẽ. Nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy vi
sinh vật lại dễ kiếm và rẻ tiền, do đó dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme sẽ
đem lại hiệu quả kinh tế lớn.
Một trong các chế phẩm enzyme được ứng dụng nhiều nhất là pectinase.
Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
dệt, y dược và nông nghiệp.
Trong công nghiệp sản xuất nước rau quả, một hiện tượng gây ảnh hưởng
không tốt đến chất lượng sản phẩm trong quá trình tồn trữ là nước rau quả bò hoá
đục. Nguyên nhân chủ yếu là do trong các loại rau quả chứa một lượng lớn hợp
chất pectin. Có nhiều giải pháp để giải quyết vấn đề trên, trong đó giải pháp sử
dụng các chế phẩm enzyme thủy phân pectin là cho hiệu quả và tốt hơn cả.
Hiện nay trong sản xuất công nghiệp, các chế phẩm pectinase được thu nhận
từ các nguồn vi sinh vật như nấm mốc hoặc vi khuẩn… chủ yếu bằng phương pháp
nuôi cấy bề mặt hay bề sâu. Để đáp ứng cho yêu cầu tự động hóa, cơ giới hóa
trong công nghiệp, phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi
trong sản xuất các chế phẩm enzyme. Trên cơ sở đó, chúng tôi bước đầu khảo sát
quá trình sinh tổng hợp pectinase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy bề sâu,
từ đó tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy nhằm thu nhận pectinase có hoạt
tính cao.
-2-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
-3-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Pectin:[7,8]
1.1.1. Nguồn gốc:
Pectin có mặt trong quả và củ. Pectin có chức năng duy trì hình dáng và sự
vững chắc của trái cây. Người ta thấy có 2 dạng tồn tại của pectin là protopectin
không tan (là phức chất giữa pectin và các thành phần khác như cellulose và
hemicellulose làm nên cấu trúc vách tế bào) và pectin tan là chất có trong thành
phần dòch bào của thực vật.
Từ thời tiền sử, chất pectin đã là thành phần trong khẩu phần ăn của con
người. Nhưng chỉ mới trong nửa thế kỷ trước, ngành công nghiệp thực phẩm mới
nhận biết được vai trò quan trọng của phụ gia pectin trong việc đa dạng hóa các
sản phẩm thực phẩm.
Trong công nghiệp, pectin được thu nhận từ dòch chiết của các nguyên liệu
thực vật, thường là táo hay các quả có múi.
Đối với việc sản xuất nước quả, sự có mặt của pectin là điều không mong
muốn và không có lợi. Do nó có tính chất keo nên làm cho dòch quả có độ nhớt cao,
vì thế sẽ làm cản trở các quá trình như ép, lọc, trích ly dòch chiết từ quả. Ngoài ra,
pectin còn làm giảm độ bền keo của nước quả.
1.1.2. Cấu tạo của pectin:
Pectin là một polysaccharide dò thể, mạch thẳng, cấu tạo từ acid
polygalacturonic đã được ester hóa 1 phần hay toàn bộ với rượu methylic.
Acid polygalacturonic là 1 polymer của acid D-monogalacturonic liên kết với
nhau bằng liên kết
α
1,4-glucoside.
Tùy thuộc nguồn gốc pectin mà mạch acid polygalacturonic dài hay ngắn, do
đó khối lượng phân tử của chúng cũng khác nhau, dao động trong khoảng 20.000-
200.000 đơn vò. Ví dụ như: phân tử lượng của pectin từ táo, mận là 25.000-35.000,
từ nguồn cam là 50.000.
Ở thực vật, có sự biến đổi giữa thành phần protopectin và pectin trong quá
trình chín của quả. Khi quả xanh, hàm lượng protopectin trong quả rất cao, phân
tán chủ yếu ở thành tế bào và có tác dụng làm cho quả cứng. Đến khi quả chín,
dưới tác dụng của các acid hữu cơ và vai trò xúc tác của enzyme protopectinase có
-4-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
trong quả, protopectin không tan sẽ chuyển dần sang dạng protopectin tan và pectin
làm quả mềm ra.
Phân tử pectin
1.1.3. Một số tính chất của pectin:
Pectin thương phẩm là chất bột màu trắng xám hay vàng nhạt, tan trong nước,
dung dòch đường, kiềm, carbonat natri và trong glycerin nóng. Pectin không tan
trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin dễ dàng bò kết tủa bởi ethanol,
isopropanol, sulfat amon, clorua nhôm, muối đồng, muối canxi và bởi acid.
Ở trạng thái dung dòch, pectin có những đặc tính công nghệ quan trọng như: là
chất làm đặc, chất ổn đònh cấu trúc, chất tạo gel, trong đó khả năng tạo gel là quan
trọng nhất.
Pectin hòa tan khi bò tác dụng của các chất kiềm loãng hoặc enzyme
pectinesterase sẽ giải phóng rượu methylic và acid polygalacturonic tự do. Acid
polygalacturonic kết hợp với ion canxi sẽ cho ra canxi polygalacturonate kết tủa.
Tính chất này được ứng dụng để đònh lượng pectin.
1.1.4. Phân loại pectin:
1.1.4.1. Theo tỉ lệ % nhóm methylen trong phân tử pectin:
 HMP: High Methoxyl Pectin: DE >50%.
 LMP: Low Methoxyl Pectin: DE

50%.
Với DE (degree of esterification): là phần trăm về số lượng của các gốc acid
galacturonic được ester hóa trên tổng số lượng gốc acid galacturonic có trong phân
tử.
1.1.4.2. Theo khả năng hòa tan trong nước:
 Pectin hòa tan: methoxyl polygalacturonic.
-5-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
 Pectin không hòa tan: protopectin là dạng kết hợp giữa pectin với các
polysaccharid khác.
1.2. Enzyme pectinase: [2,3,5,8,9]
Enzyme pectinase là nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành là
acid galacturonic, oligogalacturonic, polygalacturonic mạch ngắn, methanol...
Enzyme pectinase rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Nó có nhiều trong lá và
củ khoai tây, trong chanh, cà chua và trong các loại quả khác. Ngoài ra, nó cũng
được tạo thành từ các vi sinh vật như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men.
1.2.1. Phân loại enzyme pectinase:
Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng và kiểu phản ứng của enzyme, năm
1966 Koller và Newkom đã chia pectinase thành 2 nhóm chính:
 Nhóm enzyme hydrolase: gồm pectinesterase và polygalacturonase
 Nhóm enzyme trans-eliminase: gồm pectinlyase và pectatelyase
1.2.1.1. Nhóm enzyme hydrolase:
Là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân pectin. Gồm có các enzyme sau:
 Polygalacturonase
 Pectinesterase
a) Enzyme polygalacturonase (viết tắt PG):
Là enzyme xúc tác thủy phân liên kết
α
-1,4-D-galacturosiduronic giữa các
gốc acid galacturonic trong pectin và acid polygalacturonic, tách các gốc D-
galacturonic thành các phân tử D-galacturonic tự do. Có 2 loại polygalacturonase là
endo-polygalacturonase và exo-polygalacturonase:
 Endo-polygalacturonase: là enzyme có tác dụng cắt giữa mạch các phân tử
pectin hoặc các phân tử acid polygalacturonic, tạo thành các mạch ngắn hơn làm
cho độ nhớt của dung dòch pectin giảm đi nhiều. Thông thường, endo-
polygalacturonase chỉ xúc tác thủy phân liên kết
α
-1,4-D-galacturosiduronic giữa
2 nhóm acid galacturonic không bò methyl hóa [13].
 Exo-polygalacturonsase: là enzyme có khả năng phân cắt dần dần từng gốc
acid galacturonic bắt đầu từ đầu không khử của mạch. Enzyme này không làm
-6-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
giảm rõ rệt độ nhớt của dung dòch pectin, nhưng làm tăng hàm lượng các chất chiết
có phân tử lượng thấp trong quá trình trích ly dòch quả.
Không những thế, một số endo và exo-polygalacturonase có thể tác dụng
được trên pectin đã methyl hóa. Do đó có tên là endo hay exo-
polymethylgalacturonase. Một số khác chỉ có khả năng phân cắt những cơ chất
pectin đã mất hết nhóm methyl, nghóa là chỉ tác dụng trên acid polygalacturonic.
[12]
Endo-polygalacturonase còn có tên nữa là polygalacturonase “dòch hóa”. Còn
exo-polygalacturonase còn có tên là polygalacturonase “đường hóa”. Đó là do cơ
chế thủy phân của chúng tương tự như
α
-amylase và glucoamylase trên cơ chất
amylo của tinh bột.
Các sản phẩm của quá trình thủy phân bởi polygalacturonase có thể là các
acid polygalacturonic mạch ngắn, tetra-galacturonic, tri-galacturonic, di-
galacturonic, mono-galacturonic...
pH tối ưu của các polygalacturonase khá khác nhau và phụ thuộc vào nguồn
thu nhận enzyme. Và chúng hoạt động tốt chủ yếu trong vùng pH từ 4 đến 6.
Nhiệt độ tối thích của đa số polygalacturonase chủ yếu nằm trong vùng từ 40-
45
0
C, enzyme bò vô hoạt ở 55-65
0
C. Các polygalacturonase được hoạt hóa bởi các
cation của kim loại kiềm và NH
4
+
.[2]
O
H
H
OH
OH
H
H
O
O
OH
H
H
OH
OH
H
H
COOH
COOH
H
H
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
O
O
OH
H
H
OH
OH
H
H
COOH
COOH
H
H
O
OH
H
H
OH
OH
OH
H
H
COOH
H
O
H
H
OH
OH
H
H
COOH
O
H
O
+
exo-polygalacturonase
Cơ chế tác dụng của exo-polygalacturonase
-7-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
O
H
H
OH
OH
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
COOH
O
COOH
H
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
H
O
O
H
H
OH
OH
OH
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
COOH
O
COOH
H
O
OH
H
H
OH
OH
H
COOH
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
O
endo-polygalacturonase
+
Cơ chế tác dụng của endo-polygalacturonase.
b) Enzyme pectinesterase (viết tắt là PE):
Đây là enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin để tạo
thành methanol và acid polygalacturonic.
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester
nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. Và enzyme sẽ thủy phân lần lượt các liên kết
ester dọc theo phân tử pectin. Người ta cũng thấy rằng PE của nấm mốc thủy phân
pectin sâu sắc hơn PE của thực vật. Hoạt độ của PE phụ thuộc nhiều vào mức độ
ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận với mức độ ester hóa. Ví dụ như PE từ nấm mốc
A. niger, chỉ xúc tác cơ chất pectin ester hóa ở mức độ cao (DE không nhỏ hơn
70%).
pH tối ưu của PE từ nấm mốc dao động từ 4,5 đến 5,5. Trái lại, pH tối ưu của
PE từ thực vật thường nằm trong khoảng từ 6 đến 8.
Nhiệt độ tối ưu của PE từ nấm mốc thay đổi từ 40 đến 45
0
C. Khi tăng nhiệt độ
đến 55-62
0
C thì enzyme bò vô hoạt. Trong khi đó, PE thu nhận từ thực vật lại có
nhiệt độ tối ưu cao hơn, từ 55-60
0
C.
Các ion Na
+
, Ca
2+
, K
+
có tác dụng hoạt hóa enzyme PE từ nấm mốc, còn các
ion: Hg
2+
, Pb
2+
, Fe
3+
, Al
3+
sẽ có tác dụng kiềm hãm hoạt tính của PE.
O
H
H
OH
OH
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
COOH
O
H
H
COOCH
3
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
COOH
O
H
H
COOH
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
O
H
H
OH
OH
H
COOH
O
H
H
O
CH
3
OH
pectinestearase
+
-8-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Cơ chế tác dụng của enzyme pectinesterase
1.2.1.2. Nhóm enzyme trans-eliminase:
Là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin bằng con đường
khác con đường thủy phân, kết quả là tạo ra các sản phẩm có chứa gốc galacturonic
có chứa nối đôi (4-dezoxy-5-cetogalacturonic).
Các enzyme trans-eliminase thường gặp gồm có:
 Pectinlyase (poly-[1,4-
α
-D methoxygalacturonide] lyase): là enzyme phân
cắt hợp chất pectin.
 Pectatelyase (poly-[1,4-
α
-D galacturonide] lyase): là enzyme phân cắt
hợp chất polygalacturonate (hay pectate).
Trans-eliminase từ những nguồn khác nhau thì có các tính chất khác nhau. Ví
dụ như trans-eliminase từ nấm mốc hoạt động tối ưu ở pH 5.2, trái lại trans-
eliminase từ vi khuẩn hoạt động tối ưu ở pH từ 7 đến 8.5.
Cơ chế tác dụng của enzyme pectatelyase
-9-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Cơ chế tác dụng của enzyme pectinlyase.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase
ở vi sinh vật:
Hiện nay trong sản xuất công nghiệp, các chế phẩm pectinase chỉ được thu
nhận từ vi sinh vật. Do đó trong luận văn tốt nghiệp này, chúng tôi chỉ đề cập đến
công nghệ sản xuất chế phẩm pectinase theo phương pháp vi sinh.
1.2.2.1. Vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp pectinase:
Người ta thường thu nhận pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường
bề sâu của nấm mốc. Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzyme này:
 Nấm mốc: Nhiều loài nấm mốc có thể sản xuất ra enzyme pectinase. Loài
nấm mốc Aspergillus niger là được sử dụng nhiều nhất. Ngoài ra, người ta còn sử
dụng các loài nấm mốc khác như Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori,
Thermoascus aurantiacus và Penicillium expansum.... Các loài nấm mốc khác nhau
thường sinh tổng hợp các kiểu enzyme khác nhau. Ví dụ như: A. niger chủ yếu là
tổng hợp ra pectinesterase. Pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase.
 Vi khuẩn: một số loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme
pectinase như: Erwinia caralovora, Bacillus polymyxa, các loài thuộc giống
Streptomyces...
 Nấm men: một số loài nấm men cũng có thể tạo ra enzyme pectinase.
Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces fragilis có khả năng tạo ra endo-
polygalacturonase [12]
-10-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Tóm lại, tùy vào vi sinh vật sử dụng mà ta có thể thu nhận được hỗn hợp
enzyme pectinase có những đặc tính khác nhau.
1.2.2.2. Ảnh hưởng của các cấu tử trong môi trường dinh dưỡng: [2]
Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh
vật và quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase. Vi sinh vật muốn phát triển cần
phải có các nguồn dinh dưỡng cung cấp các hợp chất chứa C, N, H và O. Trong
thành phần môi trường cũng phải có chứa các chất khoáng như Mg, Ca, P, S, Fe,
K,..
a) Ảnh hưởng của nguồn Carbon:
Enzyme pectinase cũng thuộc nhóm enzyme cảm ứng như các enzyme thủy
phân khác. Do đó, việc chọn đúng cơ chất cho vi sinh vật sử dụng là rất quan trọng.
Nguồn carbon thường sử dụng nhất là các polysaccharide, disaccharide,
monosaccharide…
Đặc biệt, sự có mặt của pectin trong môi trường là không thể thiếu, vì pectin
vừa có vai trò là chất cảm ứng lại vừa là nguồn cung cấp carbon cho cho vi sinh vật
phát triển. Ta có thể bổ sung pectin vào môi trường bằng cách thêm vào môi
trường pectin hoặc những nguyên liệu giàu pectin như bột táo, bã củ cải đường, bã
mía hay vỏ của các loại quả có múi…
Đối với một số loài vi sinh vật, khi trong môi trường có sử dụng phối hợp giữa
pectin với các loại đường như glucose, saccharose, fructose thì đường có thể gây ức
chế quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase. Ví dụ như khi ta nuôi cấy A. niger,
nếu môi trường chỉ có nguồn carbon là pectin thì hoạt tính của PE là 0,127 UI/ml và
của PG là 0,055UI/ml sau 48 giờ nuôi cấy. Nhưng khi thêm glucose vào môi trường
với hàm lượng là 5g/l thì hoạt tính của PE chỉ còn khoảng 0,08 UI/ml và của PG là
0,03 UI/ml [16].
b) Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Nguồn thức ăn nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong quá sinh tổng hợp
enzyme pectinase. Nguồn nitơ sử dụng có thể là nước chiết ngô, bột đậu nành, bột
mì, dòch thủy phân casein, pepton… hay là các hợp chất nitơ vô cơ. Nguồn nitơ vô cơ
sử dụng có thể ở dạng muối amon hay muối nitrat như (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
NO
3
,
(NH
4
)
2
HPO
4
, NaNO
3
… Việc sử dụng các loại muối amon có thể làm giảm pH của
môi trường trong quá trình nuôi cấy do quá trình vận chuyển ion NH
4
+
từ môi trường
-11-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
vào bên trong tế bào chất của vi sinh vật xảy ra kèm theo với quá trình vận chuyển
ngược ion H
+
từ bên trong tế bào chất ra môi trường bên ngoài. Tỉ lệ thích hợp giữa
carbon và nitơ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loài vi sinh vật sử dụng,
thông thường tỉ lệ này là 7:1 [4].
Các muối amon và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được vi sinh vật hấp thu dễ
dàng và nhanh chóng sử dụng chúng, còn nitơ của nitrate sẽ được khử thành dạng
nitrite rồi mới được vi sinh vật hấp thu [2].
Người ta nhận thấy nguồn nitơ sử dụng cũng ảnh hưởng khá nhiều lên hoạt
tính của vi sinh vật. Ví dụ như: khi khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác
nhau lên hoạt tính pectinase của Streptomyces sp, sau 24 giờ nuôi cấy, người ta thu
được kết quả sau: [17]
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên hoạt tính enzyme pectinase của
Streptomyces sp.
Nguồn Nitơ (hàm lượng: 0,5%w/v) Hoạt tính pectinase (UI/l)
Peptone
Tryptone
Chiết xuất nấm men
NH
4
NO
3
(NH
4
)
2
HPO
4
NaNO
3
KNO
3
(NH
4
)
2
SO
4
66
65
57
50
48
60
54
62
Việc lựa chọn nguồn nitơ và hàm lượng sử dụng cho mỗi loài vi sinh vật sẽ
được xác đònh bằng phương pháp thực nghiệm.
c) Ảnh hưởng của các nguyên tố khác:
Sự có mặt của các chất khoáng đa lượng và vi lượng cũng ảnh hưởng lớn đến
quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Do chúng là thành phần cấu tạo
nên một số hợp chất và cơ quan trong tế bào.
-12-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Ví dụ như phosphor, lưu huỳnh rất cần cho vi sinh vật, vì chúng tham gia vào
thành phần của những chất quan trọng của tế bào (a. nucleic, protein). Ngoài ra,
phosphor còn tham gia vào rất nhiều phản ứng trao đổi chất của tế bào. Các
nguyên tố như sắt, kẽm, đồng, coban… rất cần thiết cho vi sinh vật để cấu tạo nên
một số loại enzyme dù rằng hàm lượng của các nguyên tố ấy rất nhỏ.
Các nguyên tố đa lượng được đưa vào thành phần môi trường ở dạng muối vô
cơ, còn các nguyên tố vi lượng được đưa vào từ nguồn nước máy, nước giếng hoặc
nguyên liệu hữu cơ.
Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết của các muối khoáng đối với vi khuẩn,
nấm mốc thường thay đổi trong phạm vi sau đây:
Bảng 2.2: Nồng độ các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật phát triển [7]
Muối khoáng Nồng độ cần thiết (g/l)
Đối với vi khuẩn Đối với nấm mốc
K
2
HPO
4
KH
2
PO4
MgSO
4
.7H
2
O
MnSO
4
.4H
2
O
FeSO
4
.7H
2
O
ZnSO
4
.7H
2
O
CaCl
2
CaSO
4
.5H
2
O
0,2-0,5
0,2-0,5
0,1-0,2
0,005-0,01
0,005-0,01
0,001-0,005
0,01-0,03
0,001-0,005
1-2
1-2
0,2-0,5
0,02-0,1
0,05-0,2
0,02-0,1
0,01-0,1
0,01-0,05
Thành phần tham khảo của một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo
phương pháp bề sâu với mục đích sinh tổng hợp enzyme pectinase được trình bày
trong bảng 2.3.
-13-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Bảng 2.3: Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi
cấy bề sâu [11,12,14,18]
A. niger A. oryzae Bacillus sp Streptomyces sp
Pectin: 15g/l
(NH
4
)
2
SO
4
: 2g/l
KH
2
PO
4
: 4g/l
NaHPO
4
: 0,2g/l
FeSO
4
: 0,1g/l
CaCl
2
: 0,01g/l
MnSO
4
: 37,8mg/l
H
3
BO
3
: 10mg/l
pH: 4,5
Bột mì: 40g/l
Petin: 10g/l
Chất chiết nấm
men: 0,5g/l
(NH
4
)
2
SO
4
: 5g/l
KH
2
PO
4
: 2,5g/l
MgSO
4
: 0,5g/l
FeSO
4
.7H
2
O:6x10
-5
g/l
ZnSO
4
: 6x10
-5
g/l
MnSO
4
: 10
-6
g/l
pH: 4
Petin: 2,5g/l
Chất chiết nấm
men: 10g/l
CaCl
2
: 0,05g/l
pH: 7,2
Glucose: 5g/l
Chất chiết nấm
men: 5g/l
KH
2
PO
4
: 1g/l
MgSO
4
.7H
2
O:
0,1g/l
pH: 8
Ngoài ra, các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp
nuôi cấy, nhiệt độ và điều kiện nuôi cấy... đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng
hợp enzyme pectinase.
1.2.3. Phương pháp thu nhận enzyme pectinase: [2, 4]
Để thu được enzyme pectinase từ vi sinh vật, ta có 2 phương pháp nuôi cấy:
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt
 Phương pháp nuôi cấy bề sâu
1.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt:
Trong phương pháp này, người ta thường sử dụng vi sinh vật là nấm mốc hoặc
xạ khuẩn. Vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hạt chất dinh dưỡng
rắn đã được làm ẩm. Vi sinh vật sẽ lấy thức ăn từ những chất có trong môi trường
và sử dụng oxy phân tử của không khí để hô hấp. Môi trường để nuôi cấy vi sinh
vật thường là cám mì, cám gạo, bã cà phê, hạt đậu đã được hấp chín. Trong những
-14-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
nguyên liệu này có chứa nhiều chất dinh dưỡng và chúng cũng có cấu trúc cần thiết
để giữ ẩm cho môi trường. Trong điều kiện đó, hệ sợi nấm của vi sinh vật sẽ phát
triển nhanh chóng và đồng bộ, lượng enzyme được tích lũy nhiều nhất trong canh
trường sau 48-72 giờ. Để tăng hoạt độ của enzyme pectinase, ta còn thêm vào môi
trường những vật liệu có chứa những chất cảm ứng cần thiết giàu pectin như bột cà
rốt, bột táo, hay pectin, …
Muốn cho môi trường đạt được độ thoáng khí, người ta có thể thêm trấu, mùn
cưa,… nhất là trong trường hợp sử dụng cám mòn để làm môi trường. Tuy nhiên,
những phụ liệu này có thể là những chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase và hemicellulase. Thường những phụ liệu này sẽ làm nghèo môi trường
đi, do đó nếu thêm vào nhiều hơn 15-20% thì sẽ làm giảm hoạt độ của các enzyme
pectinase trong canh trường bề mặt. Nếu trường hợp lượng chất dinh dưỡng trong
cám gạo bò giảm đi do thêm phụ liệu thì có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ,
phosphor cũng như các nguyên liệu hữu cơ khác như malt, nước chiết ngô, dòch
khoai tây,…..
Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, các yếu tố khác như độ ẩm của môi
trường nuôi cấy, độ tơi xốp, nhiệt độ, thời gian nuôi… cũng ảnh hưởng đến quá trình
sinh tổng hợp enzyme. Hàm ẩm tối ưu của môi trường nếu vượt quá 70% thì môi
trường sẽ dính bết lại gây khó khăn cho việc thông khí. Nhưng nếu độ ẩm chỉ 45-
50% thì môi trường sẽ khô nhanh nên cũng làm giảm khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của nấm mốc. Khi nấm mốc được nuôi cấy trong điều kiện tiệt
trùng nghiêm ngặt thì hoạt độ của enzyme sẽ tốt nhất khi hàm ẩm vào khoảng 65-
68%. Vì vậy, việc duy trì hàm ẩm tối ưu của môi trường trong suốt quá trình phát
triển của vi sinh vật sẽ rất quan trọng vì giảm hay tăng hàm ẩm quá mức cũng sẽ
làm lượng enzyme tạo ra bò giảm đi.
Quá trình nuôi cấy nấm mốc để tạo enzyme trong phương pháp nuôi cấy bề
mặt thường kéo dài từ 48-72 giờ.
Ở một số loài thuộc giống Aspergillus, sự tạo thành lượng enzyme tối đa sẽ
trùng với sự bắt đầu tạo ra đỉnh bào tử, do đó cho ngừng quá trình nuôi cấy vào lúc
này là thích hợp. Trong một số trường hợp khác, sự tích lũy enzyme có thể còn tiếp
tục kéo dài trong cả thời gian tạo ra đỉnh bào tử một cách mạnh mẽ. Và canh
trường nấm mốc hoạt động kiểu này thường có nhiều đỉnh bào tử. Do đó khi sấy,
-15-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
nghiền và bao gói canh trường thô sẽ làm cho không khí bò nhiễm bởi đỉnh bào tử
của giống vi sinh vật sử dụng. Để tránh hiện tượng này, tất cả thiết bò phải kín và
có cơ cấu hút bụi. Tốt hơn cả là trong sản xuất enzyme, chọn những chủng nấm
mốc tạo đỉnh bào tử yếu.
Toàn bộ chu trình phát triển của nấm mốc trên môi trường rắn có thể chia
thành 3 thời kì sau:
 Trong 10-14 giờ đầu, xảy ra sự nảy mầm của bào tử giống và bắt đầu mọc
nấm. Trong thời kỳ này, phòng nuôi cấy cần giữ ở nhiệt độ không dưới 28-30
0
C để
không kìm hãm sự phát triển ban đầu của chúng.
 Qua thời gian trên, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh. Thời kỳ này kéo
dài từ giờ thứ 14 đến giờ thứ 48. Nấm mốc phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng
lớn các chất dinh dưỡng, hô hấp rất mạnh và lượng nhiệt thoát ra nhiều. Vì vậy
trong lớp canh trường nhiệt độ tăng lên đến 37-40
0
C và có thể còn cao hơn, tùy
thuộc vào độ dày của lớp. Do đó cần phải thổi không khí để điều tiết nhiệt độ của
lớp canh trường.
 Thời kì thứ 3 kéo dài từ 1-20 giờ. Trong thời kỳ này, quá trình trao đổi chất
xảy ra không mạnh mẽ lắm và dần dần yếu đi, lượng nhiệt thoát ra bé hơn, nhưng
sự tạo nên enzyme có thể còn xảy ra. Phụ thuộc vào tính chất sinh lý của vi sinh
vật sử dụng và thời điểm kết thúc sinh tổng hợp enzyme, ta có thể làm ngừng sự
phát triển của nấm mốc vào một thời gian xác đònh sao cho hoạt độ của enzyme là
cao nhất.
Canh trường bề mặt của nấm mốc sau đó đem nghiền nhỏ trong máy nghiền
và sấy khô đến độ ẩm 8-12% để sử dụng. Chế phẩm enzyme dưới dạng này là chế
phẩm thô.
1.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy bề sâu:
Trong phương pháp nuôi cấy bề sâu, người ta cho vi sinh vật phát triển trong
môi trường lỏng. Các vi sinh vật được sử dụng trong nuôi cấy bề sâu gồm có vi
khuẩn, nấm men và cả nấm sợi. Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích
hợp cho mỗi loài vi sinh vật sẽ khác nhau.
-16-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Nguồn carbon thường dùng là pectin, bột táo hay bột cà rốt. Nguồn nitơ
thường dùng là nước chiết ngô, nước chiết malt, chất chiết nấm men hay nguồn nitơ
vô cơ.
Quá trình sinh tổng hợp các enzyme trong canh trường bề sâu diễn ra trong
khoảng thời gian từ 48-120 giờ tùy vào giống vi sinh vật sử dụng [11,12,13,14, 18].
Trong sản xuất hiện nay, người ta thường sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí.
Môi trường nuôi cấy phải luôn được sục khí vào liên tục và khuấy đều bằng cánh
khuấy (nếu ta sử dụng bồn lên men lỏng quy mô công nghiệp) hoặc môi trường
phải luôn được lắc đảo (nếu ta sử dụng các bình erlen ở quy mô phòng thí nghiệm)
Mục đích của quá trình này là nhằm cung cấp đủ khí oxy cho vi sinh vật phát triển.
Vì enzyme pectinase là enzyme ngoại bào và được tiết ra môi trường bên
ngoài, nên ta có thể thu được enzyme pectinase từ phần canh trường lỏng sau khi
lọc tách bỏ sợi nấm và các chất không hòa tan. Trong trường hợp này, chế phẩm
enzyme thu được là enzyme thô.
pH của môi trường cũng là 1 yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng
hợp enzyme pectinase vì mỗi vi sinh vật sẽ có một pH tối ưu để nó sinh trưởng và
sinh tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho nấm mốc là từ 4-5 và với vi khuẩn là 7-8.
Môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy bề sâu phải luôn chứa đầy đủ những muối vô
cơ cần thiết cho vi sinh vật. Thành phần và tính chất của các muối vô cơ có trong
canh trường và sự hấp thụ muối của vi sinh vật sẽ làm thay đổi giá trò pH canh
trường trong quá trình nuôi cấy.
Ví dụ như khi khảo sát ảnh hưởng giá trò pH ban đầu của môi trường lên hoạt
tính của polygalacturonase thu nhận từ Aspergillus oryzae, người ta thu được kết
quả sau:
-17-
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến hoạt tính enzyme
polygalacturonase sinh tổng hợp từ A. oryzae [15]
Nhìn vào đồ thò ta thấy giá trò pH 4.0 được xem là thích hợp nhất cho quá trình
sinh tổng hợp enzyme pectinase của chủng nấm mốc sử dụng.
1.2.3.3. So sánh phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy
bề sâu:
Khi so sánh 2 phương pháp, ta thấy phương pháp nuôi cấy bề sâu có 1 số ưu
điểm sau:
 Hàm lượng cơ chất sót không đáng kể, do đó ta có thể tiết kiệm chi phí sản
xuất.
 Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, ta sẽ dễ dàng hiệu chỉnh các giá trò
nhiệt độ, pH… của môi trường. Vì vậy quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzyme sẽ tốt hơn.
 Quá trình tinh sạch enzyme không cần qua giai đoạn trích ly.
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt ít chiếm diện tích nhà xưởng, tốn ít nhân
công hơn và dễ dàng cơ khí hoá, tự động hóa hơn so với phương pháp nuôi cấy bề
sâu.
-18-