Vi khuẩn E. coli

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu
hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên
và không gây hại trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi
sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì một số dòng E. coli độc có thể
gây bệnh trên người và một số loài động vật.
Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm
đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác
nhau. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli như: gen ehxA, stx1, stx2, và uid của
nhóm STEC (Shiga toxigenic E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC
(Enteropathogenic E. coli); …
Nhìn chung, E. coli có thể được phân lập dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường ô
nhiễm phân. Ngoài ra, E. coli còn có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không
bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật này có thể tồn tại và phát triển rất lâu trong môi trường.
Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E. coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn
hay nguồn nước nếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt. Từ đó, có
thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, và nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường
hợp gây tử vong cho người và gia súc.
Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E. coli trong phân gia súc bình thường
hoặc tiêu chảy là cần thiết, góp phần trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật và đánh
giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm. Từ đó, có những biện
pháp phòng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi. Những
tiến bộ của công nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúng ta chẩn
đoán chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyền thống
(nuôi cấy, phân lập, …). Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để
phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli phân lập được
1
từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò. Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ được ứng dụng
vào thực tiễn chẩn đoán và tầm soát bệnh cho gia súc cũng như cho con người qua con
đường thực phẩm.
1.2. Mục tiêu – yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
- Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA và uid của E. coli, đặc biệt là nhóm
STEC.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập được E. coli từ phân, thịt trên một số loại môi trường chọn lọc (MAC,
SMAC, CT - SMAC).
- Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR phát hiện một số gen độc lực của E. coli
phân lập được.
2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sống bình thường trong ruột người và động vật, nhiều nhất trong
ruột già. Vi khuẩn theo phân ra môi trường bên ngoài gây ô nhiễm cho nước, đất, không
khí, dụng cụ giết mổ, các nguyên liệu sử dụng trong chế biến thực phẩm, …
2.1.1. Đặc điểm sinh học
 Phân loại: vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia.
 Hình thái: là trực khuẩn, gram âm, di động, không bào tử, giáp mô, có lông tơ
xung quanh.
 Kích thước: khoảng 0,5 µm  2 – 3 µm.
 Đặc tính nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Có thể sinh
trưởng ở nhiệt độ 15 - 40
0
C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37
0
C, pH từ 6,4 – 7,4. Mọc
tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt,
trắng đục, khoảng 2 – 3 mm.
 Đặc tính sinh hóa: E. coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate
thành nitrite. Để phân biệt E. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử
dụng thử nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO, 1992).
2.1.2. Yếu tố kháng nguyên
Vi khuẩn đường ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính
chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết
thanh (serotype) khác nhau (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí
Minh, 1996):
 Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu
tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O là:
 Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100
o
C trong 2 giờ.
 Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
 Bị hủy bởi formol 5%.
 Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ.
3
Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng
kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi
khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.
 Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo
bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase,
không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra
hiện tượng ngưng kết H.
 Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau và
nằm ngoài kháng nguyên O. Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein. Nếu
kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết
O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô
trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu.
 Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng 4
µm, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc
ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn .
Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng
nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, người ta có thể định danh vi khuẩn.
2.1.3. Phân loại E. coli
Để phân loại E. coli gây bệnh, người ta dựa vào đặc điểm sinh bệnh như: gen độc
lực mã hóa các protein gây bệnh cho vật chủ, sự tác động khác nhau lên màng nhầy ruột,
hội chứng lâm sàng và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh. Có 5 nhóm E. coli gây
bệnh (Keskimaki, 2001):
(1) E. coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E. coli hay VTEC-
Verotoxigenic E. coli và EHEC Enterohemorrhagic E. coli ).
(2) E. coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E. coli).
(3) E. coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E. coli).
(4) E. coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E.
coli).
4
(5) E. coli tấn công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E. coli).
2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC)
Nhóm STEC được kết tội là liên quan đến nhiều đợt dịch bệnh viêm dạ dày, đã và
đang đe dọa sức khỏe cộng đồng. Vào những năm đầu thập niên 1980, các dòng STEC
gây ra những đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội
chứng huyết niệu (HUS). HUS biểu hiện ba triệu chứng điển hình là suy thận cấp, giảm
tiểu cầu và thiếu máu tan huyết do tổn thương mao mạch. Bao gồm nhiều serotype khác
nhau như O26, O111, O113, O124, O145, O157, … (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học
Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996). Hiện nay, người ta công nhận các dòng STEC gây
bệnh nghiêm trọng cho con người, đặc biệt O157:H7 là serotype chính của STEC gây
nhiều ổ dịch lớn trên khắp thế giới (Smith và ctv, 1988).
2.2.1. Thuật ngữ
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau
để gọi tên cho nhóm E. coli này. Thuật ngữ Verotoxigenic E. coli hay Verocytotoxigenic
E. coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc
sản xuất độc tố gây độc dòng tế bào Vero (ở thận khỉ mặt xanh châu Phi). Thuật ngữ
Enterohemorrhagic E. coli ( EHEC) chỉ những dòng E. coli gây HC và HUS (Nataro và
Kaper, 1998). Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) chỉ những serotype
E. coli sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố của vi khuẩn Shigella
(Calderwood và ctv, 1996).
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều đề cập đến E.
coli sản sinh một hay nhiều độc tố gây độc tế bào. Tuy nhiên, không phải chỉ có gen sản
sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác. Những dòng E.
coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng
rất ít, nhưng những dòng này thiếu một hay vài yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin
và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và
Kaper, 1998).
2.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC
2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx)
5
Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phát hiện năm 1897, sản sinh độc tố
thường được gọi là Shiga. Và sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản xuất độc tố
tác động tương tự như Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro và Kaper, 1998).
Stx là một ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh
trung ương. Ở ruột, E. coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường và các axit
amin ở ruột non. Ở hệ thần kinh, nó gây biểu hiện lâm sàng trầm trọng có thể tử vong
(Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 1996). Trong số hơn 200
serotype E. coli có thể sản sinh độc tố Stx thì có hơn 50 serotype gây HC hay HUS ở
người (Nataro và Kaper, 1998).
 Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chính
không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì
Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều biến chủng như Stx2c, Stx2hp, Stx2e ... Một
dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2, hoặc cả Stx1 lẫn Stx2, và thậm chí nhiều
dạng của Stx2.
Những nghiên cứu đầu thập niên 80 đã xác định Stx1 và Stx2 được mã hóa trên
thực khuẩn thể và thực khuẩn thể này chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli (O’Brien và
ctv, 1984).
Bảng 2.1 Danh pháp các thành viên trong họ Stx
Tên gọi hiện nay
Gen Protein
Shiga toxin (Stx) stx Stx
Shiga like toxin I (SLT_I) hay Verotoxin 1 (VT1) stx1 Stx1
SLT_II hay VT2 stx2 Stx2
STL_II c hay VT2c stx2c Stx2c
STL_II e hay VT2e stx2e Stx2e
(Nguồn: Calderwood và ctv, 1996)
6
Tất cả độc tố Stx đều gồm hai thành phần cấu tạo (Paton và Paton, 1998):
- Tiểu đơn vị A , 32 kDa, gồm peptide A
1
28 kDa và peptide A
2
4 kDa nối với
nhau bằng cầu nối disulfit. Peptide A
1
có hoạt tính enzyme và peptide A
2
có nhiệm vụ
gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B.
- Năm tiểu đơn vị B, có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa. Các tiểu đơn vị B giúp
độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu của nó.
Vai trò của Stx trong sinh bệnh: Để gây bệnh, trước tiên Stx phải được tiếp
nhận bởi các thụ thể đặc hiệu. Các nghiên cứu cho thấy rằng Stx có tính chất gây độc
trực tiếp lên tế bào ruột do chúng nhắm đến thụ thể Gb
3
(globotriaosylceramide), dạng
thụ thể glycolipid, trên nhung mao của tế bào biểu mô ruột ở động vật (Stx2e có thụ thể
là Gb
4
). Gb
3
hoặc Gb
4
còn tìm thấy ở tế bào nội mô thận, tế bào Vero, tế bào Hela... Nhờ
tính đặc hiệu của tương tác này và sự phân bố của các thụ thể thay đổi theo loại tế bào
đã ảnh hưởng chính đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996).
Sau khi làm hư hại các tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô, xâm
nhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể glycolipid, gây
tổn thương tế bào nội mạch, tế bào thận … Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc tố
kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này. Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu
đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, rồi cắt một gốc
adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Vì
không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết. Hậu quả là gây tiêu
chảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS). Trong khi đó, hậu
quả do Stx2e là hiện tượng phù thủng ở heo sau cai sữa (trích dẫn của Lê Thị Mai
Khanh, 2004).
Ảnh hưởng của các loại Stx trong sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ ra
rằng những dòng STEC chỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với những
dòng STEC chỉ sản sinh Stx1, bệnh càng nặng hơn nếu dòng STEC sản sinh cả Stx1 lẫn
Stx2, chẳng hạn như HUS (Paton và Paton, 1998).
7
2.2.2.2. Enterohemolysin (haemolysin)
Enterohemolysin tồn tại ở nhiều dạng (α, β và …) trong các E. coli xâm lấn hay
sinh độc tố đường ruột (Manil và Daube, 2005). Độc tố này được tìm thấy ở hầu hết các
dòng O157:H7 và các dòng STEC không phải O157:H7. Enterohemolysin thuộc nhóm độc tố
RTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ như chân lông (RTX family of
pore-forming cytolysin) (Paton và Paton, 1998). Và RTX hiện diện trong E. coli gây
bệnh đường huyết niệu (uropathogenic E. coli), Pasteurella haemolytica và các tác nhân
khác gây bệnh cho người, động vật (Bauer và Welch, 1996).
Haemolysin do gen ehxA nằm trên plasmid 60 MDa pO157 mã hóa. Gen ehxA có
60% tương đồng với hlyA; hlyA cũng là gen cấu trúc mã hóa haemolysin ở E. coli gây
bệnh đường huyết niệu và cho kiểu dung huyết α-haemolysin (α-Hly). Ngoài ra, gen
cấu trúc ehxA có nhiều biến thể, được chia thành hai nhóm: nhóm 1 gồm nhiều loại
EHEC phổ biến như O157:H7, O26, O111; trong khi đó, nhóm 2 gồm nhiều serotype
khác còn lại cũng có tính chất gây bệnh. Gần đây, các nghiên cứu về di truyền học đã
chỉ ra rằng gen ehxA của những dòng STEC có trình tự giống nhau trên 98%, nhưng vẫn
có sự khác nhau lớn ở một số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng và Monday, 2000).
Beutin và ctv (1989) đã khảo sát và khẳng định rằng đa số các dòng STEC đều
cho kiểu dung huyết alpha (α-Hly). Các dòng sản sinh độc tố này thì không gây dung
huyết trên thạch máu nhưng tạo thành vòng dung huyết nhỏ, mờ trên thạch máu cừu
(có bổ sung Ca
2+
) sau khi ủ qua đêm. Hiện tại, phương thức tham gia gây bệnh của
enterohaemolysin vẫn chưa được biết rõ. Chính sự dung huyết trở thành nguồn cung cấp
Fe kích thích sự phát triển STEC trong ống tiêu hoá (Law và Kelly, 1995).
2.2.2.3. Yếu tố bám dính
Yếu tố bám dính của STEC đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong sự
định vị vi khuẩn ở ruột. Đó là intimin, một protein màng ngoài có trọng lượng phân tử
94-97 kDa. Intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin
gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy, gọi là bệnh tích A/E (attaching and effacing)
ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Có 4
loại intimin, được kí hiệu là α, β, γ, và ε. Trong đó:
8
 α-intimin thường được tìm thấy ở những dòng E. coli thuộc nhóm EPEC ở
người và chó.
 β-intimin có ở những dòng E. coli thuộc nhóm EPEC và EHEC ở người và thỏ.
 γ-intimin chủ yếu ở nhóm STEC của người và động vật, ở EPEC của người.
 ε-intimin hiện diện trong những dòng E. coli thuộc nhóm EHEC ở bò và người
(Oswald và ctv, 2000).
Có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae và khả năng gây bệnh trầm trọng của các
dòng STEC trên người như HC và HUS. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ của các dòng
mang gen eae ở bệnh phẩm người cao hơn trên gia súc. Hơn nữa, sự hiện diện dòng
STEC mang gen eae trên gia súc thường liên quan đến các dòng vi khuẩn E. coli độc lực
trên người mà khoa học đã từng biết, chúng thuộc serotype O157, O26, O111, …
(Sandhu và ctv, 1996).
Ngoài ra còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây
bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS
(lipopolysaccharide).
2.2.3. Cách sinh bệnh
Cách sinh bệnh là một quá trình gồm nhiều bước, liên quan đến sự tương tác phức
tạp giữa số lượng vi khuẩn và các yếu tố của vật chủ. Cấp STEC qua đường miệng (chỉ
cần liều rất thấp) thì vi khuẩn phải sống sót trong điều kiện môi trường khắc nghiệt của
dạ dày và chúng phải cạnh tranh với các vi khuẩn khác ở đường ruột để thiết lập sự định
cư. Vi khuẩn STEC sống sót trong đường ruột, nhân lên và sản sinh Stx rồi được hấp
thu qua tế bào biểu mô ruột, dẫn truyền vào dòng máu. Điều này cho phép toxin đặc
hiệu đến bề mặt tế bào đích gồm cả tế bào ruột lẫn các nội quan khác (Paton và Paton,
1998).
Định cư vào ống tiêu hoá: vi khuẩn có khả năng bám vào tế bào biểu mô ruột
và định cư trong ống tiêu hoá người là một trong những yếu tố quyết định độc lực.
Người ta ước tính liều gây nhiễm của vài dòng STEC (O111:H- và O157:H7) khoảng 1–
100 CFU (colony forming unit) (Paton và ctv, 1996).
9
Sức đề kháng acid của STEC: Nét đặc trưng của các dòng STEC là khả năng
định cư ở ống tiêu hóa người, với số lượng cảm nhiễm thấp. STEC đề kháng được pH
acid của dạ dày. Do đó, dòng STEC O157:H7 vẫn còn sống sót trong các thực phẩm
acid cao (Leyer và ctv, 1995). Tính trạng này được điều hòa bởi gen rpoS. Gen này có
khả năng giúp vi khuẩn E. coli kéo dài thời gian sống sót ở pH dưới 2,5 (Paton và Paton,
1998). Gần đây, Waterman và Small (1996) báo cáo tình trạng đột biến của gen này.
Điều này góp phần giải thích những dòng STEC có khả năng gây cảm nhiễm khác nhau.
Kiểu bám vào tế bào biểu mô ruột: STEC có khả năng sống sót trong điều kiện
khắc nghiệt của dạ dày. Chúng phải thiết lập sự định cư này bằng cách bám vào các tế
bào biểu mô ruột. STEC định cư được ở đoạn kết tràng (colon) và có lẽ cũng ở đoạn xa
ruột non người; mặc dù hiện tượng này chưa được chứng minh trực tiếp. Ngay cả những
dòng trong serotype O157:H7 vẫn có sự bám dính khác nhau, điều này phản ánh nhiều
cơ chế bám khác nhau.
Vai trò của plasmid 60 MDa (pO157) cho STEC bám dính: Hầu hết các dòng
STEC đều chứa pO157 này. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của plasmid
liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) và sự bám dính với tế bào Henle 407 nhưng không
bám vào tế bào HEp-2. Theo Tzipori và ctv (1987), có hiện diện plasmid hay không có
đều không ảnh hưởng đến khả năng định cư ở kết tràng của STEC và khả năng gây bệnh
tích A/E trên heo con sinh ra bằng cách mổ lấy thai.
2.2.4. Khía cạnh lâm sàng
Ngày nay, người ta công nhận rằng có sự phân bố rất rộng về bệnh ở người liên
quan đến các vi khuẩn sản sinh độc tố Stx. Những bệnh liên quan tới STEC thường gắn
liền với những ổ dịch nhỏ rải rác lẫn những ổ dịch lớn có nguồn gốc ngộ độc thực
phẩm.
Nhiều bệnh nhân nhiễm STEC với triệu chứng đầu tiên là tiêu chảy, một số
trường hợp thì sau một hay hai ngày thì tiêu chảy lẫn máu và HC. Đau bụng dữ dội cũng
thường xảy ra. Đối với những bệnh nhân nhiễm STEC gây tình trạng HUS thì dễ để lại
di chứng do sự tổn thương cấp tính ở thận, sự thiếu máu do dung huyết và giảm tiểu
cầu. Vài cá thể bị HUS thì có triệu chứng thần kinh như bơ phờ, nhức đầu dữ dội, co
giật và đau não. Mặc dù HUS xảy ra trên tất cả các nhóm tuổi nhưng tỉ lệ mắc bệnh do
STEC ở trẻ em và người già thường cao hơn, điều này có thể do sự đáp ứng miễn dịch
10
kém ở hai lứa tuổi này. Sự cải thiện trong kiểm soát lâm sàng và kỹ thuật thẩm tách thận
đã làm giảm tỉ lệ chết do HUS từ 50% xuống hơn 10% trong hai – ba thập niên vừa qua.
Tuy nhiên, số lượng người sống sót (khoảng 30%) phải chịu đựng ốm yếu triền miên,
bao gồm suy thận mãn tính, tăng huyết áp và suy yếu hệ thần kinh.
Tiến trình bệnh do STEC gây ra có hay không có biến chứng tùy thuộc vào sự tác
động qua lại giữa vi khuẩn và vật chủ. Trong một ổ dịch, tuổi của người bệnh ảnh
hưởng đến tỉ lệ mắc cũng như tỉ lệ chết. Những nghiên cứu gần đây về các ổ dịch lớn
gây ra bởi STEC thuộc serotype O157:H7 cho thấy khoảng 5 – 10% bệnh nhân tiêu chảy
tiến triển để hình thành HUS do STEC (Paton và Paton, 1998).
2.2.5. Dịch tễ học
Trong nhiều năm qua, người ta thừa nhận rằng những dòng STEC gây bệnh trên
người thuộc các tuýp huyết thanh O:H phổ rộng. Karmali (1989) đã liệt kê 32 serogroup
O (tương đương với 60 tuýp O:H khác nhau). Trên khắp thế giới, các dòng STEC thuộc
serotype O157:H- là nguyên nhân chính gây bệnh cho người. Việc phân lập các serotype
này thường dựa vào khả năng không lên men sorbitol nên đã góp phần đánh giá quá cao
tỉ lệ mắc phải nhóm này so với các serotype khác. Khi một tuýp được phân lập là O157,
có lẽ có khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnh của các tuýp khác.
Trong khi đó, các serotype STEC không thuộc O157:H7 cũng là nguyên nhân nổi bật
gây bệnh cho người.
Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tễ đã chứng minh rằng các dòng
STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều loài vật nuôi như bò, cừu, heo, dê, chó, mèo
(Beutin và ctv, 1995) và cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997). Do đó, STEC tồn lưu trong gia
súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhất là từ trâu
bò.
STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ
người qua người. Cụ thể, STEC có thể xâm nhập vào chuỗi sản xuất thực phẩm cho con
người từ nguồn gốc vật nuôi, vấy nhiễm thông thường nhất cho thịt là phân hoặc các
thành phần trong ruột sau khi hạ thịt (Paton và Paton, 1998).
Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh. Thời
gian bài thải O157 qua phân là 2 – 4 tuần, nhưng khoảng 13% bệnh nhân thải O157 hơn
11
một tháng và triệu chứng bệnh không biểu hiện trong giai đoạn sau. Như vậy nguy cơ
truyền lây giữa người – người là cao (Keene và ctv, 1994).
2.2.6. Chẩn đoán
Có những khó khăn liên quan đến chẩn đoán cảm nhiễm do STEC. Trong giai
đoạn đầu, STEC tồn tại nhiều trong phân; có nhiều trường hợp, STEC chiếm trên 90%
quần thể vi sinh vật hiếu khí (Paton và ctv, 1996). Tuy nhiên, lúc bệnh thuyên giảm, số
lượng này giảm nhanh cực kỳ. Đối với những bệnh nhân HUS, triệu chứng dạ dày ruột
có thể chỉ xuất hiện một tuần hoặc nhiều tuần, và ở thời điểm này số lượng STEC hiện
diện trong phân rất ít. Trong vài trường hợp, tiêu chảy không kéo dài và nếu lấy bệnh
phẩm qua trực tràng thì số lượng sẽ hạn chế. Vì những lí do này, yêu cầu của phương
pháp chẩn đoán thích hợp phải nhạy, nhanh và đòi hỏi khối lượng mẫu tối thiểu. Các qui
trình chẩn đoán thường tập trung vào việc phát hiện Stx, đặc biệt là Stx trong phân. Do
các qui trình khác nhau về tính phức tạp, thời gian, độ nhạy, tính chuyên biệt và giá
thành, vì vậy phải có chiến lược chẩn đoán thích hợp tùy hoàn cảnh và nguồn mẫu
(Paton và Paton, 1998).
2.2.7. Phòng ngừa
E. coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nước, không khí. Ngoài
ra, bệnh có thể lây truyền từ người sang người do tay bẩn, thực phẩm và nước uống bị
nhiễm. Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và
người già.
Vì vậy, phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý
phân và dụng cụ của bệnh nhân. Không nên ăn những loại thực phẩm không đảm bảo
chất lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín vì chúng có thể là nguồn truyền
nhiễm STEC. Có thể xác định chỉ số E. coli trong nước để xem nước có nhiễm bẩn hay
không.
2.3. Serotype O157:H7
Theo thống kê về tình hình các ổ dịch bệnh do nhiễm phải STEC thì hầu hết các
trường hợp đều do serotype O157:H7 gây ra (Nataro và Kaper, 1998). Điều này cho
thấy serotype này nguy hiểm hơn, dễ lây lan bệnh hơn so với các serotype khác. Lần đầu
tiên, serotype O157:H7 được phân lập và định danh vào năm 1982. E. coli O157:H7
12
ngày càng có tác động lớn ở Mỹ và châu Âu. Hàng năm, ở Mỹ có trên 73000 ca ngộ độc
thực phẩm do nhiễm phải O157:H7, trong đó có 61 trường hợp tử vong. Nguyên nhân
do ăn phải thịt bò chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươi hay do truyền
lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of
Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004). Từ đó, người ta xem O157:H7
là nguyên nhân phổ biến nhất cho HC và HUS.
Serotype này có một số đặc điểm khác biệt so với các serotype E. coli khác:
- Nhạy cảm với nhiệt độ, không phát triển được ở nhiệt độ 44 – 44,5
0
C (Jay, 2000).
- Không có khả năng lên men D-sorbitol trong 24 giờ. Trong khi đó có đến 75 –
94% những dòng E. coli khác lại lên men sorbitol. Do đó, người ta thay thế môi trường
MacConkey có lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol để phân lập (Smith và
Scotland, 1993).
- Không biểu hiện hoạt tính β-D-glucuronidase (GUD): Điểm khác biệt về sinh
hóa của dòng O157:H7 là không cho GUD dương tính, trong khi đó khoảng 90 – 95%
chủng E. coli cho GUD dương tính. Và người ta dựa vào đặc tính này để phân biệt
O157:H7 với các dòng E. coli khác (Monday và ctv, 2001).
GUD là enzyme xúc tác sự thủy phân β-D-glucuronide thành rượu và
glucuronate. Mặc dù không biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang
đoạn gen uid hoàn chỉnh (gồm cả vùng điều hòa) trên nhiễm sắc thể. Kiểu hình đặc
trưng này là do đã xảy ra các đột biến trên gen uid. Hầu hết các đột biến trên uid ở
O157:H7 là đột biến thoái hóa, ví dụ như đột biến điểm thay thế T bằng G ở vị trí 92 so
với E. coli thuộc chủng hoang dại (wild-type) (Feng và Lampel, 1994) hay đột biến do
sự chèn thêm hai base G-G ở vị trí +686 trên uid ở serotype O157:H7 (Monday và ctv,
2001). Tóm lại, những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của
GUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, không thực hiện chức năng
thủy phân của nó được. Và điều này vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.
- Kháng kháng sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine và các tác
nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thông thường) (Kim và ctv,
1994).
13
- Tính kháng acid (acid resistance - AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng
sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid. E. coli O157:H7 có khả năng sống sót
trong môi trường acid từ pH = 2 đến pH = 7. Chẳng hạn, O157:H7 sống đến 56 ngày ở
pH >= 4 trong môi trường TBS (Tryptic Soybean Broth), ngoài ra nó không phát triển ít
nhất 5 giờ ở pH 3 -2,5 khi nhiệt độ 37
o
C trong môi trường canh Luria có điều chỉnh pH
bằng HCl (trích dẫn bởi Jay, 2000). Đặc tính kháng acid này do gen rpoS qui định. Có 3
hệ thống AR khác nhau (Foster, 2004):
(1) Hệ thống AR1: chỉ hoạt động khi tế bào tăng trưởng trong môi trường yếm khí
với sự vắng mặt của glucose.
(2) Hệ thống AR2: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của glutamate.
(3) Hệ thống AR3: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của arginine.
Ba hệ thống này hoạt động suốt quá trình tăng trưởng ở pha cân bằng (stationery
phase) của vi khuẩn.
- Khả năng chịu mặn: Trong canh khuẩn 4,5% NaCl, vi khuẩn tăng số lượng gấp
3 lần khi tăng thời gian lên 2 lần, và không phát triển khi ≥8,5% NaCl (Jay, 2000).
2.4. Kỹ thuật PCR
2.4.1. Khái niệm
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát
minh năm 1985 đã và đang được sử dụng rộng rãi. Đây là một phương pháp tạo dòng in
vitro, không cần sự hiện diện của tế bào.
2.4.2. Nguyên tắc
Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA, là phản
ứng gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước:
 Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ thường sử dụng là
94 – 95
0
C
 Bước 2: là giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ dao động trong khoảng
40
0
C – 70
0
C.
14
 Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation hay extension), thường ở nhiệt độ
72
0
C.
Một chu kì gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và sau mỗi lần lặp lại
sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA của lần trước. Số chu kì thường theo kinh nghiệm và có
thể trong khoảng 25 – 30 chu kì, tùy theo lượng của mẫu DNA lúc bắt đầu và độ nhạy
mong muốn.
2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR
- Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme
sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP,
rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ MgCl
2
trong hỗn hợp phản ứng cuối
cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5 mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
- Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP,
dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
- Mồi (primer): là những oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình
tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Các chuỗi primer
nên được thiết kế để nhân một đoạn DNA sao cho đạt chiều dài tối hảo là 100 – 1000
bp mặc dù trong vài trường hợp sản phẩm chỉ 10 bp.
- Taq polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn
Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác
tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg
2+
. Hoạt lực của
Taq bị ảnh hưởng rất lớn bởi nồng độ Mg
2+
. Nồng độ tối hảo Mg thường là 1,5 mM
(Trần Thị Dân, 2001).
- DNA mẫu xét nghiệm.
2.4.4. Phân tích kết quả PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tùy vào mục đích mà người ta sử dụng nhiều kỹ
thuật sinh học phân tử khác nhau để phân tích sản phẩm của phản ứng PCR như đọc
15
trình tự sản phẩm PCR, tạo dòng sản phẩm PCR … Tuy nhiên, công việc đầu tiên sau
khi thực hiện phản ứng PCR là phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di.
Sau khi điện di, các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ
ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào các base của các nucleotide và phát
huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV.
Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một “yếu tố đánh
dấu trọng lượng phân tử “ (molecular weight marker - MWN) hay còn gọi DNA ladder
(thang chuẩn).
2.4.5. Multiplex – PCR
Là phản ứng PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều đoạn
DNA trong cùng một phản ứng PCR. Phương pháp này được thử nghiệm thành công
vào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều công trình nghiên cứu. Cho đến nay, vẫn chưa
có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứng multiplex
– PCR. Do vậy, ứng với mỗi một điều kiện phản ứng, cần phải điều chỉnh cho phù hợp
với mục đích mong muốn.
2.4.6. Ứng dụng
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với
nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, khảo cổ, pháp y và hình sự.
Trong nghiên cứu genome, PCR được ứng dụng trong nhân bản vô tính, multiplex
PCR, cloning cDNA bằng PCR đảo (inverse PCR), recombinant PCR,...
Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh virus, vi
khuẩn, protozoa lẫn ký sinh trùng đa bào.
Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, sử dụng PCR để phát hiện gen
halothan, gen thụ thể estrogen, gen thụ thể prolactin … trong công tác chọn giống vật
nuôi, phát hiện các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm : E. coli, Salmonella,
Staphylococcus aureus, Campylobacter, ...
16