khảo sát sự biến động mật độ vi khuẩn bacillus subtilis trong bể nuôi tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
LÂM TRUNG TÍNH
KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ
(PENAEUS MONODON)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN
2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
LÂM TRUNG TÍNH
KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ
(PENAEUS MONODON)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN
2009

i
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thuỷ Sản,
Quý Thầy Cô và toàn thể cán bộ Khoa Thuỷ Sản đã tận tình giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Đặc biệt tôi sinh chân
thành biết ơn cô Phạm Thị Tuyết Ngân và chị Liễu Như Ý cùng các cán bộ bộ
môn Thuỷ Sinh Học Ứng Dụng, các bạn lớp Bệnh Học Thuỷ Sản K 31 đã tận
tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ để tôi hoàn thành luân văn.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, đặc biệt là cha mẹ
đã dành cho tôi những tình cảm, sự động viên cũng như hỗ trợ về vật chất để
tôi vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học.
Chân thành cảm tạ Sinh viên thực hiện
Lâm Trung Tính
TÓM TẮT
Đánh giá khả năng làm sạch môi trường nước của nhóm vi khuẩn chọn lọc, được phân
lập từ những ao nuôi tôm sú thâm canh đã được thực hiện, là một trong những bước
quan trọng trong qui trình chọn lọc vi khuẩn hữu ích. Bacillus subtilis từ lâu đã được
chứng minh là vi khuẩn tham gia trong quá trình phân hủy protein trong nuôi trồng
thủy sản.
Thí nghiệm được bố trí gồm có 4 nghiệm thức, trong đó 3 nghiệm thức bổ sung vi
khuẩn Bacillus subtilis chủng 9, 41, 67 và một nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm
thức được lập lại 3 lần. Kết quả cho thấy thời gian tồn tại trong bể tôm của vi khuẩn
dòng 9 là 7 ngày, dòng 41 và 67 là 5 ngày. Mật độ bào tử trong bùn của 3 chủng 9, 41
và 67 lần lượt là 5,3×10
6
, 5,95×10
5
và 3,5×10
5
bào tử/g. Trong khi đối chứng chỉ
khoảng 22 bào tử/g cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức
còn lại (p< 0.05). Trong nước mật độ chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 3×10
3
, 4,9×10
2

2,9×10
2
bào tử/ml, còn đối chứng chỉ 10 bào tử/ml cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05). Mật độ tổng vi khuẩn trung bình
trong bùn chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 5,2 x 10
7
, 6,7x 10
6
, 6,7 x 10
6
CFU/g, còn đối
chứng 3,8 x 10
8
CFU/g . Trong nước chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 3,7 x 10
5
, 4,3x 10
5
,
57 x ,10
5
CFU/ml, còn đối chứng 5 x 10
7
CFU/ml, có số lượng tăng cao khác biệt có ý
nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05). Mật độ vi khuẩn Vibrio
trong bùn, chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 7,6 x 10
1
, 2,1x 10
2
và 3,7 x 10
2
CFU/g, thấp
hơn nhiều so với đối chứng (5,8 x 10
4
CFU/g). Trong nước mật độ chủng 9, 41,và 67
lần lượt là 4,1 x 10
1
, 1,9x 10
2
và 3,5 x 10
2
CFU/ml, đối chứng 6,4 x 10
4
CFU/ml có số
lượng tăng cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p<
0.05). Tỉ lệ tăng trưởng đạt cao nhất ở nghiệm thức 1 (chủng 9) tăng 10,7g/con và sai
khác có rất có ý nghĩa thống kê (p<0,01) so với nghiệm thức đối chứng tăng 5,3g/con
và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức bổ sung vi khuẩn dòng 41 và
dòng 67 (p< 0.01). Tỷ lệ sống ở nghiệm thức 1 (chủng 9) cao nhất 97,2% và sai khác
rất có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (p<0,01). Trong khi đó tỉ lệ sống giữa
các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn sai khác không có ý nghỉa thống kê. Các chỉ tiêu
sinh hóa cơ bản đều thỏa mản điều kiện của Andretta et at., (2004).
Qua thí nghiệm nhận thấy chủng 9 là chủng có nhiều ưu thế nhất về thời gian tồn
tại, làm tăng tỷ lệ sống, tỷ lệ tăng trưởng và làm giảm mật độ vi khuẩn Vibrio
trong bể nuôi tôm.
ii
iii
MỤC LỤC
PHẦN I: GIỚI THIỆU 1
2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú (Penaeus monodon) 3
2.1.1 Vị trí phân loại: 3
Theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989. Tôm sú 3
2.1.2 Phân bố 3
2.1.3 Vòng đời 3
2.1.4 Tập tính ăn và loại thức ăn 4
2.1.5 Lột xác 4
2.2 Sự siến động các yếu tố thuỷ lý trong ao nuôi thuỷ sản 4
2.2.1 Nhiệt độ 4
2.2.2 pH 4
2.2.3 Độ mặn 5
2.2.4 Oxy hoà tan (DO) 5
2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản 5
2.3.1 Sơ lược về probiotic 5
3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản 6
2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 7
2.4.1 Vị trí phân loại 7
2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis 7
2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis 8
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 10
3.1.1 Thời gian nghiên cứu 10
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 10
3.2 Phương pháp nghiên cứu 10
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị: 10
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 10
3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước 12
3.2.4 Phương pháp thu mẫu bùn 14
3.2.4.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 14
3.2.5 Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis. 15
3.2.6 Phương pháp xác định sự biến động các yếu tố thuỷ lý 15
3.2.7 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm 15
3.2.8 Tính tốc độ tăng trưởng của tôm 16
3.2.9 Tính tỉ lệ sống của tôm 16
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1 Sự biến động các chỉ tiêu thủy lí 17
4.1.1 ảnh hưởng của pH 17
4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17
4.1.3 Ảnh hưởng của độ kiềm 17
4.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (DO) 17
iv
4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis phân
lập. 18
4.4 Biến động mật độ Vi khuẩn Bacillus subtilis trong bể nuôi tôm Sú 23
4.5 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong bể nuôi tôm Sú 24
4.6 Biến động mật độ tổng vi khuẩn Vibrio trong bể nuôi tôm Sú 26
4.7 Tỉ lệ sống 27
PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31
4.1 Kết luận. 31
4.2 Đề xuất 31
PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.1 Các bước pha loãng mẫu…………… 13
Hình 3.2 Cách cấy mẫu vào môi trường thạch………… 13
Hình 4.1 Khuẩn lạc sau 24 giờ…………………………………… 19
Hình 4.2 Nhuộm Gram………………………………… 19
Hình 4.3 Nhuộm bào tử………………………………………… 20
Hình 4.4 Phản ứng Starch……………………………………… 20
Hình 4.5 Phản ứng Gelatin……………………………… 21
Hình 4.6 Phản ứng Thủy phân Casein……………………………. 21
Hình 4.7 Thời gian tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtiilis trong bùn… 22
Hình 4.8 Thời gian tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtiilis trong nước… 22
Hình 4.9 Biến động mật độ Bacillus subtiilis trong bùn…… 23
Hình 4.10 Biến động mật độ Bacillus subtiilis trong nước……… 23
Hình 4.11 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong bùn……………. 25
Hình 4.12 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước…………… 25
Hình 4.13 Biến động mật độ Vibrio trong bùn…………………… 27
Hình 4.14 Biến động mật độ Vibrio trong nước……………… 27
Hình 4.15 Tỉ lệ sống của tôm sú…………………… 28
Hình 4.16 Tỉ lệ tăng trưởng của tôm sú………………… 29
Hình 4.17 Tôm sú sau khi thu hoạch……………………………… 30
v

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1 Tỉ lệ sống của tôm sú…………………………… 23
Bảng 4.2 Tỉ lệ tăng trưởng của tôm sú………………………………………… 24
Bảng 4.3 Các chỉ tiêu sinh hóa để nhận dạng Bacillus subtilis ……………… 27
vi
1
PHẦN I: GIỚI THIỆU
Trong khoảng 10 năm gần đây nghề nuôi tôm ở Vịêt Nam đang phát triển mạnh mẽ.
Tính đến tháng 6/2005 diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 542.900 ha, tăng 11.2% so với
cùng kỳ năm 2004, sản lượng nuôi đạt 562.800 tấn, trong đó Đồng Bằng Sông Cửu
Long chiếm 67.1% (Bộ Thuỷ Sản, 2006).
Chính lợi nhuận từ việc nuôi thuỷ sản quá cao mà người dân không ngừng mở rộng
diện tích nuôi, tăng mật độ nuôi và mùa vụ thả nuôi. Từ đó, dẫn đến tình trạng ô nhiễm
môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thuỷ sản do phần lớn các vật
chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và chất thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi. Ngoài
ra, còn các hoá chất, kháng sinh sử dụng trong quá trình nuôi tích luỹ không được xử lý.
Do đó, vấn đề cần thiết nhất hiện nay là quản lý tốt môi trường ao nuôi nhằm hạn chế
tình trạng bệnh trên các đối tượng thuỷ sản, giúp nuôi trồng thuỷ sản phát triển bền
vững và bảo vệ môi truờng. Xu hướng hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng để giải quyết vấn đề trên là sử dụng các vi sinh vật hữu ích được phân lập từ bùn
đáy và nước ao nuôi. Các sản phẩm vi sinh vật hữu ích này gọi là chế phẩm sinh học
(Probiotic).
Trong nuôi tôm thâm canh cao sản, hai yếu tố quan trọng quyết định năng suất là tôm
giống sạch bệnh và môi trường ao nuôi. Hiện nay, tình hình trên đang đặt ra cho các
nhà khoa học nhiều vấn đề cần giải quyết đặc biệt là phương pháp xử lý bùn đáy trong
những ao, đầm nuôi tôm việc làm sạch và duy trì ao nuôi sạch vẫn còn nhiều bất cập
khiến cho những người nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro. nuôi tôm mật độ cao. Tình trạng
nhiễm bẩn nặng của ao nuôi tôm mặc dù đã được khắc phục bằng giải pháp thay nước
sạch thường xuyên hay nước đã được xử lý, song phần bùn ao - nơi các chất thải tích tụ
trong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi khuẩn và ký sinh trùng gây bệnh
phát triển. Mỗi năm, lượng bùn tích tụ ở đáy ao nuôi tôm thâm canh hình thành một lớp
bùn dày 10-15 cm, tương đương 30-50 tấn chất khô giàu hữu cơ/ha. Bùn có thành phần
chủ yếu là chất hữu cơ, bao gồm sinh khối vi sinh vật và xác động, thực vật thủy sinh.
Khi phân hủy tự nhiên sẽ làm cạn kiệt lượng oxy hòa tan và sinh ra các chất độc hại đối
với tôm như NH
3
, H
2
S, CH
4
(trích dẫn Nguyễn Thị Chính, 2006).
Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa bệnh”.
Hiện nay, nhiều mô hình nuôi tôm bền vững được đề xuất và áp dụng như nuôi tôm
thân thiện với môi trường, nuôi tôm an toàn sinh học…
2
Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc sử dụng các vi sinh vật hữu
ích để tạo các chế phẩm sinh học. Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều
nhất là nhóm Bacillus, hầu hết các loài thuộc giống Bacillus không độc hại cho người
và động vật thủy sản (trích dẫn bởi Olmos, 2005)
Hiện nay, ở nước ta người dân nuôi thủy sản sử dụng chế phẩm sinh học rất phổ biến để
cải thiện chất lượng nước. Nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá xem các chủng vi
sinh vật hữu ích khi đưa vào môi trường nước có tồn tại và phát triển hay không từ vấn
đề trên đề tài "Khảo sát Sự biến động mật độ của vi khuẩn Bacillus subtilis trong
bể nuôi tôm sú (Penaueus monodon)” được thực hiện với mục tiêu và nội dung sau.
Mục tiêu
Xác định thời gian cần thiết để bổ sung vi khuẩn hữu ích Bacillus subtilis vào bể nuôi
tôm sú.
Xác định mật độ và sự biến động của Bacillus subtilis trong một chu kỳ nuôi. Phân lập
và xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn chiếm ưu thế trong bể nuôi tôm sú.
Nhằm khẳng định lại dòng ưu thế là dòng đã bổ sung.
Nội dung
Theo dõi và xác định thời gian bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis và theo dõi biến động
mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi bổ sung vào bể nuôi.
Xác định sự biến động của tổng vi khuẩn, tổng Vibrio trong bể nuôi tôm sú trên môi
trường Nutrient Agar (NA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS).
Xác định sự biến động của vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường chuyên biệt đồng
thời định danh lại các dòng vượt trội này bằng một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi
khuẩn
3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú (Penaeus monodon)
2.1.1 Vị trí phân loại:
Theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989. Tôm sú thuộc
Ngành: Arthopoda – Ngành chân khớp
Ngành phụ: Antennata – Ngành phụ có râu
Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác
Bộ: Decapoda - Bộ 10 chân
Bộ phụ: Natantia - Bộ phụ bơi lội
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeidea - Họ tôm he
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus monodon
2.1.2 Phân bố
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan
phía đông Tahiti, phía Nam Châu Úc và phía Tây Châu Phi (Racek, 1955; Holthuis và
Rosa, 1965; Motol, 1981,1985). Tôm bột, tôm giống và tôm tiền trưởng thành có tập
tính sống gần bờ biển và vùng rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển
xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn.
2.1.3 Vòng đời
Tôm cái có kích thước lớn hơn tôm đực, tuổi thành thục từ tháng thứ 8 trở đi. Tôm đẻ
quanh năm nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính là tháng 3-4 và tháng 7-10. Tôm cái
đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ được 14-15 giờ ở
nhiệt độ 27-28ºC nở thành ấu trùng. Ấu trùng phát triển qua các giai đoạn sau:
Nauplius: 6 giai đoạn; Zoea: 3 giai đoạn; Mysis: 3 giai đoạn. Tuổi thọ tôm đực khoảng
1,5 năm; tôm cái khoảng 2 năm.
4
2.1.4 Tập tính ăn và loại thức ăn
Tôm sú thích ăn động vật sống hơn xác thối rửa hay mảnh vụn hữu cơ. Tôm bắt mồi
nhiều hơn khi thuỷ triều rút. Nuôi tôm sú trong ao hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng
sớm và chiều tối. Trong tự nhiên tôm chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn (3-
45‰), độ mặn tối ưu là 15-25‰. Ở nhiệt độ 28ºC tôm sú lớn tương đối chậm, ở nhiệt
độ 30ºC tôm lớn nhanh hơn nhưng dễ mắc bệnh. Nhiệt độ tối ưu cho tôm sú phát triển ở
vùng ao hồ nhiệt đới là 28-30ºC
2.1.5 Lột xác
Theo Phạm Văn Tình (2000) Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích
thước tăng lên mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ củ để lớn lên. Sự lột xác
thường xảy ra vào ban đêm, sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường
hợp lột xác mà không tăng thể trọng. Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác
xảy ra như sau.
Lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra
trước, theo sau là phần bụng và phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác
uốn cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ đối với tôm nhỏ,
1-2 ngày đối với tôm lớn. Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với
môi trường sống thay đổi đột ngột. Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này,
có thể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời (Phạm Văn Tình, 2004).
2.2 Sự siến động các yếu tố thuỷ lý trong ao nuôi thuỷ sản.
2.2.1 Nhiệt độ
Trong các ao nuôi nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
các chất hữu cơ cho cơ thể sinh vật, cũng như vai trò phân huỷ của vi sinh vật và trao
đổi chất của tôm nuôi. Theo Whetstone et al., (2002) tôm có thể sống tốt ở nhiệt độ 23-
34
0
C tối ưu là 26 - 29
0
C nhưng không thay đổi quá 5
0
C trong ngày (Boyd et al., 2003).
2.2.2 pH
Theo Chanratchakool et al., (1995) thì pH của nước rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp
hoặc gián tiếp đến tôm nuôi. pH thích hợp cho tôm nuôi 7.50 - 8.35 và khoảng dao
động hằng ngày không vượt quá 0.5 đơn vị pH. Theo Phạm Văn Tình (1994) thì pH
trong ao nuôi thương thấp vào buổi sáng và cao vào buổi chiều, pH của nước trong ao
tốt nhất là 7.50 - 8.50 là thích hợp cho ao nuôi tôm sú.
5
2.2.3 Độ mặn
Tôm sú là đối tương nuôi rộng muối, chúng có thể sống ở những nơi có độ mặn từ 3-
45‰. Wannina Yake et al., (2001) cho rằng độ mặn tối ưu cho sinh trưởng và phát triển
của tôm sú là 15-20‰.
2.2.4 Oxy hoà tan (DO)
Oxy hoà tan lý tưởng cho tôm sú là trên 5ppm (Swingle, 1969 được trích bởi Lê Bảo
Ngọc., 2005) và không vượt quá 15ppm (Whetstone et al.,2002) theo nghiên cứu của
Summerfelt (1996) thì hàm lượng oxy hoà tan trong nước chịu sự chi phối của nhịêt độ,
nhịêt độ càng tăng thì oxy hoà tan trong nước càng giảm. Hàm lượng DO ở mức thích
hợp cho sự sinh trưởng tối ưu cho tôm là 5-6ppm (Boyd et al., 2003).
2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản
2.3.1 Sơ lược về probiotic
“Probiotic là hổn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi
đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi
trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của
thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm
bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống” (Phạm Thị Tuyết
Ngân, 2007).
Probiotic bao gồm những vi khuẩn có lợi (vi sinh vật hữu ích) và trong thủy sản hầu
hết những sinh vật này là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus plantarum, L.
acidophillus, L. casei, L. rhamnosus, L. bulgaricus, Carnobacterium…), giống Vibrio
(Vibrio alginolyticus), giống Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B.
polymyxa,…), Actinomycetes, Nitrobacteria…được áp dụng trong các bể ương nuôi,
trong ao để hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh (Xiang-Hong et al.,
1998; Lê Đình Duẩn và ctv, 2007). Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv
(2007) một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các
enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase,
một số vitamin thiết yếu và chất khoáng. Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp
xử lý nước và nền đáy ao thường bổ sung thêm các chủng nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc
nhóm Aspergillus, Streptomyses ).
Theo Nair et al., 1985 vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có khả năng
tiết ra chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio
parahaemolyticus. Sử dụng các nhóm vi khuẩn có lợi phân lập từ ruột cá bơn
6
(Scophthalmus maximus) trong ao nuôi có thể kìm hãm vi khuẩn V. anguillarum gây
bệnh (Olsson et al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn có lợi đã cạnh tranh có
hiệu quả với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007).
Nghiên cứu của Xiang-Hong et al., (1998) cũng cho biết một số vi khuẩn hữu ích có
thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo. Tác giả còn cho biết thêm những vi
khuẩn có lợi trong nước sẽ loại trừ nhanh NH
3
, H
2
S, vật chất hữu cơ có hại. Ngoài ra,
chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi.
Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh vật hữu
ích trong nuôi trồng thủy sản. Vì thế, Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi
khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến chất lượng nước, do vi
khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO
2
. Vì vậy,
Bacillus sp giúp giảm tích lủy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị
Tuyết Ngân, 2007).
3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản
Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng
sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh
của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu quả sản
xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998).
Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế
phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng
khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còn
tăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng.
Theo (Vijayabaskar et al., 2008) ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ thể là
nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do vi
khuẩn A. hydrophila gây ra.
Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippine, khi việc sử dụng
kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn
kháng thuốc, mà xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con người
nếu sử dụng quá liều lượng. Vì lý do đó mà probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghề
nuôi tôm ở Philippine, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khi
trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty, 1999).
Một nghiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sịnh học trong nuôi thủy sản cho
kết quả rất khả quan, không chỉ cải thiện chất lượng nước, giảm lượng dùng kháng
7
sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng
của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998).
Probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi thủy sản. Nhưng việc sử dụng
Probiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản chất của các vi sinh vật có ích và
đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi (Balcázar et al., 2006).
2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis
2.4.1 Vị trí phân loại
Giới : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp : Bacilli
Bộ : Bacillates
Họ : Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
(http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/subtilisin
)
Năm 1872, Ferdinand Cohn (một sinh viên của Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là
B. subtilis. B. subtilis là trực khuẩn gram dương, di động, có kích thước 2–3 x 0,7 -
0,8µm. Chúng có khả năng hình thành bào tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng
như khi sống thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi như khang hiếm chất dinh
dưỡng. Ở điều kiện 100ºC, bào tử B. subtilis chịu được 180 phút. Bào tử có tính ổn định
cao với nhiệt độ thấp, sự khô cạn, tác động của hóa chất và tia bức xạ.
(http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/subtilisin
2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis
Khi môi trường bị thay đổi một cách đột ngột hoặc thiếu thức ăn, các loài thuộc giống
Bacillus và Clostridia tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động tạm thời gọi là nội bào tử
giúp chống lại sự phá hủy thành tế bào (Driks, 1999). Nội bào tử của vi khuẩn được
sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi. Đó là
loại tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh
(Nguyễn Lân Dũng, 1983). Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về bào tử của
B. anthracis có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà khoa học
nghiên cứu về bào tử với mục đích khám phá ra như thế nào loại tế bào ngưng hoạt
8
động đặc biệt có thể chịu nhiệt độ và các điều kiện gây sốc khác. Theo Driks (1999),
bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử. Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiều
lớp bao quanh bào tử được cấu thành bởi 25 loại polypeptide liên kết chéo chặc chẽ với
nhau. Tuy nhiên lớp áo bào tử cũng cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trường
thích hợp. Bào tử có thể chuyển đổi thành tế bào phát triển thông qua một quá trình gọi
là sự nẩy mầm.
Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh. Nhiều
loài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các polymer sinh học
(protein, starch, pectin,….), đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh học Nitơ
và Carbon.
Quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn khoảng 8 giờ để hoàn thành (Driks, 1999).
Trong quá trình hình thành bào tử, nhiểm sắc thể nhân đôi thành các bản sao riêng biệt.
Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiểm sắc thể nằm trong bào tử, sau đó hình thành hai tế
bào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng thích. Theo Nguyễn Lân Dũng
(1983) phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận
lợi bào tử này sẻ nẩy mầm và mỗi bào tử sẽ chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng.
Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất
kì điều kiện nào, chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào trong môi trường
nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không. Tuy nhiên, có sự chấp nhận rằng sự
hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh và trong suốt pha tĩnh (Banwart,
2000).
2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis
Mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh thường tích lũy nhiều vật chất hữu cơ ở đáy ao do
thức ăn dư thừa, phân và các chất thải khác của thuỷ sinh vật làm môi trường sống của
vật nuôi bị ô nhiễm tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát gây thiệt hại lớn trong nuôi
thuỷ sản. Chất lượng nước và việc kiểm soát bệnh là vấn đề rất quan trọng trong các ao
nuôi, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạt động của vi sinh vật (Jory,
1998). Vì vậy, vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thuỷ vực giữ vai trò rất quan
trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thuỷ sản thâm
canh (Avnimelech et al., 1995). Hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng
nước chủ yếu là sử dụng oxygen, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừ các sản
phẩm độc trong trao đổi chất như NH
3
, NO
2
-
, H
2
S (Moriarty, 1996).
Nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình thành bào tử là Bacillus spp đã được sử
dụng như một chế phẩm sinh học từ rất lâu giúp cải tiến chất lượng nước nhờ vào tác
9
dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ và làm giảm số lượng mầm bệnh tiếp cận với các
loài thuỷ sản nuôi (Wang et al., 1999).
Không chỉ vậy bào tử Bacillus cũng được sử dụng như một tác nhân sinh học giúp giảm
bệnh Vibrio trong hệ thống nuôi thuỷ sản (Skjermo và Vadstein, 1999; Rengipipat et
al., 2000). Bào tử vi khuẩn Bacillus IP5832 đưa vào môi truờng nuôi luân trùng dùng
làm thức ăn cho cá bơn (Gatesoupe, 1991)
Meunpol et al., (2002) sử dụng probiotic với dòng vi khuẩn Bacillus S11 trộn vào thức
ăn viên công nghiệp cho ấu trùng tôm sú ăn. Sau khi cho ăn thức ăn trộn probiotic trong
1 tháng thì cấy vi khuẩn Vibrio harveyi rồi sục ozone vào từng bể (0,3333 - 0,341 mg
O
3
/ml). Tỉ lệ sống của tôm được xác định sau 6 ngày đạt cao nhất 75% so với nghiệm
thức đối chứng tỷ lệ sống chỉ có 18%.
Vi khuẩn hữu ích đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là liên
quan đến sản xuất sơ cấp, phân hủy chất hữu cơ, cải thiện chất lượng nước trong ao.
Chúng còn chuyển hóa các chất độc như ammoniac và hợp chất nitơ. Trong thủy vực,
các vật chất hữu cơ không ngừng bị phân hủy bởi các vi sinh vật vì chúng cần các hợp
chất này để làm thức ăn. Các chất hữu cơ được chúng hấp thụ làm tiền chất cho việc
xây dựng cấu trúc cơ thể và tạo năng lượng cho các hoạt động sống. Khi ấy, hợp chất
hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng trong
những điều kiện thích hợp thì chuyển hóa ngược lại thành các chất vô cơ ban đầu được
gọi là quá trình vô cơ hoá. Quá trình này sẽ tái tạo trở lại vòng tuần hoàn trong thủy
vực, tạo nên sự sinh trưởng mới của thực vật. Nếu không có vi sinh vật phân hủy hữu
cơ thì toàn bộ quá trình chuyển hóa vật chất trong thủy vực sẽ ngừng lại và sự sống sẽ
không tồn tại được (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005 ).
10
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
3.1.1 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 06 năm 2009
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
Tại Trại Cua và phòng thí nghiệm Vi Sinh – Bộ Môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng Khoa
Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị:
12 bể Composite thể tích 500L.
Máy đo độ mặn, máy đo pH, nhiệt kế, đĩa secchi, máy sục khí
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị 12 bể Composite thể tích 500L được tiệt trùng. Sau đó cho bùn tiệt trùng vào,
lượng bùn cho vào mỗi bể khoảng 45kg. Nước sau khi xử lý bơm vào bể với thể tích
khoảng 400L. Mật độ thả tôm 30 con/m
2
.
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức.
Nghiệm thức 1: bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 9, mật độ 10
6
CFU/ml.
Nghiệm thức 2: bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 41, mật độ 10
6
CFU/ml.
Nghiệm thức 3: bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 67, mật độ 10
6
CFU/ml.
Nghiệm thức 4: không bổ sung vi khuẩn ( đối chứng).
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Thu mẫu
trước khi bổ sung vi khuẩn và tiếp theo 2 ngày thu một lần liên tục trong 7 ngày đầu,
sau đó định kỳ 2 tuần thu mẫu một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm
11
3.2.2.1 Chuẩn bị bùn
Bùn được lấy từ ao nuôi tôm sú thâm canh Tại Huyện Vĩnh Châu – tỉnh Sóc Trăng.
Lượng bùn cho vào mổi bể khoảng 45kg.
Trước khi bố trí vào bể bùn được xử lý bằng cách tiệt trùng ở 121
0
C khoảng 15-20
phút.
3.2.2.2 Chuẩn bị nước
Nguồn nước được lấy từ biển Sóc Trăng. Thể tích nước được bố trí vào mỗi bể khoảng
400lít, độ mặn 16‰.
Xử lý nước bằng Chlorine ở nồng độ 30ppm, sau đó tiệt trùng bằng ozone khoảng 7-8
giờ.
3.2.2.3 Bố trí tôm vào mỗi bể
Nguồn tôm lấy từ trại giống (Minh Thuận) tại Thành Phố Cần Thơ. Trọng lượng tôm
giống khoảng 0,4 gram.
Xử lý tôm trước khi cho vào bể bằng cách ngâm formol nồng độ 30ppm khoảng 15-30
phút
Mỗi bể bố trí 3 viên đá bọt dùng để sục khí. Sục khí liên tục trong suốt quá trình thí
nghiệm.
3.2.2.4 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn
Chọn 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 9, 41 và 67 đã được phân lập từ bùn đáy ao
nuôi tôm sú thâm canh tại Huyện Vĩnh Châu – Tỉnh Sóc Trăng vào tháng 1 năm 2008
đến tháng 6 năm 2008 (Lê Mỹ Phương, 2008)
Môi trường nuôi tăng sinh là môi trường Luria Bertani (LB) (phụ lục A2)
Mỗi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được cho vào môi trường LB, cho vào bình tam
giác có gắn sục khí, ở 30
0
C trong vòng 24 - 48 giờ.
Sau khi nuôi tăng sinh xác định mật độ vi khuẩn bằng 2 phương pháp.
• Phương pháp đếm trên đĩa thạch với môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus
subtilis (phụ lục A1)
• Phương pháp đo OD: sau khi nuôi tăng sinh sử dụng máy đo quang phổ tại bước
sóng 550nm để xác định giá trị OD. Mẫu đối chứng không có vi khuẩn được đo
đầu tiên và có giá trị bằng 0. Dung dịch huyền phù vi khuẩn cần đo sẽ có giá trị
12
OD trong khoảng 0,125-1,25. Theo tiêu chuẩn Mac Farland giá trị OD bằng 1
tương ứng mật độ vi khuẩn 1,2x10
9
tế bào/ml.
Mật độ vi khuẩn được tính theo công thức
Mật độ vi khuẩn (tế bào/ml) = 1200*10
6
*OD*Độ pha loãng
Bảng giá trị OD
550nm.
Giá Trị OD
550
0.125 0.250 0.500 0.750 1.000 1.250
Mật Độ Vi Khuẩn
(10
6
CFU/ml)
150 300 600 900 1200 1500
Mật độ vi khuẩn của mỗi dòng bổ sung vào mỗi bể thí nghiệm là 10
6
CFU/ml.
3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước
3.2.3.1 Chuẩn bị trước khi thu mẫu
Hệ thống ống nhựa PVC, nhiệt kế, ống falcon tiệt trùng…
Các ống nghiêm chứa 9ml nước muối sinh lý tiệt trùng (121
0
C trong 15-20 phút) .
Môi trường NA + 1,5% muối NaCl, TCBS và môi trường chuyên biệt cho Bacillus
subtilis.
Ghi nhận pH, nhiệt độ, độ mặn,… trước khi thu mẫu.
3.2.3.2 Phương pháp thu mẫu
Mẫu nước được thu bằng ống fancol tiệt trùng, thu mẫu cách mặt nước khoảng 20-
30cm. Sau đó trử lạnh ngay ở 4
0
C và tiến hành phân tích trong vòng 2 giờ.
3.2.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý (0,85%) đã tiệt trùng ở 121ºC
trong 20 phút để pha loãng mẫu.
Tại phòng thí nghiệm lấy mẫu nước ra khỏi tủ mát, để nhiệt độ phòng. Mở nắp dụng cụ
chứa mẫu trong tủ cấy tiệt trùng, chuyển 1ml mẫu nước từ mỗi bể sang các ống nghiệm
chứa 9 ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều bằng máy 1 phút. Ta được mẫu có
độ pha loãng 10
-1
. Từ mẫu này chuyển 1 ml dung dịch sang ống nghiệm khác chứa 9 ml
nước muối sinh lý được độ pha loãng 10
-2
. Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạt
được độ pha loãng thích hợp, bắt đầu từ độ pha loãng 10
-2
. Còn đối với xác định mật độ
vi khuẩn Bacillus subtilis thì sau đó xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng vào cùng
13
một giá đem sấy ở 80
0
C. Khi nhiệt độ đạt 80
0
C tính thời gian đến 30 phút rồi lấy ống
nghiệm ra.
.
Hình 3.1: Các bước pha loãng mẫu
Sau đó dùng micropipete hút 100µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa chứa môi
trường chuyên biệt cho giống Bacillus subtilis, môi trường NA và TCBS, rồi dùng que
thuỷ tinh tán đều đến khi mẫu khô. Ủ ở 28ºC trong 24 -48 giờ. Mỗi mẫu nước cần chọn
2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần.
Đĩa có chứa môi trường thạch
lấy 100µL
Mẫu nước
đã được
pha loãng
Que trang
Đèn cồ
n
Đĩa có chứa môi trường thạch
Hình 3.2: Cách cấy mẫu vào môi trường thạch
Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động từ 20 đến
200. Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và <
200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/ml nước. Xác định số lượng khuẩn
9ml 9ml9ml
9ml
Mẫu nước
10
-
1
10
-
2
10
-
3
10
-
4
1mL
1mL 1mL 1mL
14
lạc trong mỗi đĩa môi trường và tính số lượng trung bình cùng độ lệch chuẩn. Số lượng
vi khuẩn được tính bằng công thức:
Đơn vị hình thành khuẩn lạc(CFU/ml nước) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10
3.2.4 Phương pháp thu mẫu bùn
Mẫu bùn được thu bằng bộ dụng cụ thu mẫu làm bằng ống nhựa PVC (do viện nghiên
cứu sức khoẻ động vật thuỷ sản Thái Lan thiết kế). Dụng cụ được tiệt trùng bằng
Chlorine nồng độ 5 - 10ppm hoặc cồn 70
0
. Thu mẫu 12 bể thí nghiệm mỗi bể thu 1
điểm (khoảng 100 gram bùn trên điểm). Mẫu bùn cho vào ống fancol tiệt trùng và trữ
lạnh ngay ở 4
0
C. Sau đó tiến hành phân tích mẫu trong vòng 2 giờ.
3.2.4.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (0,85%) đã tiệt trùng ở 121ºC
trong 15-20 phút để pha loãng mẫu.
Tại phòng thí nghiệm lấy mẫu bùn ra khỏi tủ mát, để nhiệt độ phòng. Mở nắp dụng cụ
chứa mẫu trong tủ cấy tiệt trùng, chuyển 1 gram mẫu bùn từ mỗi bể sang các ống
nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều bằng máy 1 phút. Ta được
mẫu có độ pha loãng 10
-1
. Từ mẫu này để yên cho lắng 30 giây chuyển 1ml dung dịch ở
phần giữa ống nghiệm sang ống nghiệm khác chứa 9ml nước muối sinh lý được độ pha
loãng 10
-2
. Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp,
bắt đầu từ độ pha loãng 10
-2
chỉ lắc 30 giây và để lắng 15 giây. Còn đối với xác định
mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis thì sau đó xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng
vào cùng một giá đem sấy ở 80
0
C. Khi nhiệt độ đạt 80
0
C tính thời gian đến 20 phút rồi
lấy ống nghiệm ra.
Sau đó dùng micropipete hút 100 µL dung dịch huyền phù vi khuẩn cho vào các đĩa
chứa môi trường chuyên biệt cho Bacillus subtilis, môi trường TCBS và NA rồi dùng
que thuỷ tinh tán đều đến khi mẫu khô. Ủ ở 28ºC trong 24 -48 giờ. Mỗi mẫu bùn cần
chọn 3 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần
Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động từ 20 đến
200. Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và <
200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/g bùn. Xác định số lượng khuẩn lạc
trong mỗi đĩa môi trường và tính số lượng trung bình cùng độ lệch chuẩn. Số lượng vi
khuẩn được tính bằng công thức:
Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU/g bùn) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10