QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM ĐỂ XÉT NGHIỆM VI SINH

B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
PH N I : KHÁI QUÁT V TT Y T D PHÒNG HÀ T NH.Ầ Ề Ế Ự Ĩ 1
I) Gi i thi u v trung tâm Y t D phòng H T nhớ ệ ề ế ự à ĩ 1
1> Khái quát v trung tâm Y T D phòng H T nh.ề ế ự à ĩ 1
II> S HO T NG C AƠĐỒ Ạ ĐỘ Ủ 2
PH N II. N I DUNG TH C T P.Ầ Ộ Ự Ậ 3
PHẦN I : KHÁI QUÁT VỀ TT Y TẾ DỰ PHÒNG HÀ TĨNH.
I) Giới thiệu về trung tâm Y tế Dự phòng Hà Tĩnh
1> Khái quát về trung tâm Y Tế Dự phòng Hà Tĩnh.
Trung tâm Y tế Dự Phòng Hà Tĩnh là một đơn vị trực thuộc ngành Y tế
tỉnh Hà Tĩnh. Được thành lập ngày 29 / 10 / 1991, theo quyết định
234/TCQĐ của UBND tỉnh Hà Tĩnh trên cơ sở sát nhập 3 bộ phận Vệ Sinh
Phòng Dịch, Bướu cổ và truyền thông. Trung tâm có chức năng xây dựng kế
hoạch triển khai thực hiện các chuyên môn về Y tế Dự Phòng và hướng dẫn,
giám sát chuyên môn kỹ thuật đối với các trung tâm Y tế dự phòng Huyện,
thị, thành phố; nghiên cứu và tham gia nghiên cứu khoa học. Bác sỹ Nguyễn
Thái Hoạch được cử làm giám đốc trung tâm, bác sỹ Nguyễn Văn Hiến làm
phó giám đốc, sau này bổ sung thêm bác sỹ Nguyễn Thanh Hồ làm phó giám
đốc trung tâm.
Đầu năm 1995, bác sỹ Thái Hoạch nghỉ hưu. Bác sỹ Nguyễn Văn Hiến
được cử làm giám đốc trung tâm. Lần lượt Tiến sỹ Đường Công Lự, Thạc sỹ
Nguyễn Lương Tâm được bổ nhiệm làm phó giám đốc trung tâm.
Sau 20 năm tách tỉnh Trung tâm y tế dự phòng đã không ngừng lớn mạnh
cả về quy mô lẫn chất lượng chuyên môn. Ban đầu chỉ có 14 cán bộ trong đó
có 7 bác sỹ, đến nay Trung tâm hiện có 50 cán bộ, trong đó có:
- 01 Bác sỹ chuyên khoa 2
- 02 Thạc sỹ
- 12 Bác sỹ
- Đại học khác : 12 nhân viên
- Cao đẳng : 2 nhân viên
- Y sỹ và trung cấp khác : 18 nhân viên
- 02 nhân viên lái xe
- 01 nhân viên phục vụ
Toàn cơ quan hiện có , có 
Trung tâm được bố trí thành  phòng: khoa kiểm soát dịch bệnh và
vắc xin sinh phẩm, Khoa sức khoẻ cộng đồng và trường học, Khoa an toàn
vệ sinh thực phẩm và dinh dưỡng, Khoa nội tiết, Khoa vệ sinh lao động và
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
1
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
bệnh nghề nghiệp, Khoa kiểm dịch Y tế và xét nghiệm, phòng tổ chức hành
chính và phòng kế hoạch tài chính.
II> SƠ ĐỒ HOẠT ĐỘNG CỦA
TRUNG TÂM Y TẾ DỰ PHÒNG TỈNH
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
2
BGĐ
GIÁM ĐỐC
PHÓ GIÁM ĐỐC
PHÒNG
TỔ CHỨC - HÀNH CHÍNH
PHÒNG
TÀI VỤ - KẾ TOÁN
KHOA
KS DBTN VÀ
VACXIN
SINH PHẨM
KHOA
XÉT
NGHIỆM
KHOA
KIỂM
DỊCH
YT
KHOA
NỘI
TIẾT
KHOA
SKCĐ
KHOA
SK
NGHỀ
NGHIỆP
KHOA
ATVSTP

DD
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
   
PHẦN II. NỘI DUNG THỰC TẬP.
KHOA XÉT NGHIỆM:
 Phòng xét nghiệm vi sinh:
I. Vi Sinh Thực Phẩm. (Vệ sinh an toàn thực phẩm).
QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM ĐỂ XÉT
NGHIỆM VI SINH
 !"#$%#&'&() #*+
1) Mục đích của việc lấy mẫu thực phẩm để kiểm nghiệm vi sinh vật.
- Để xác định vi sinh vật có trong thực phẩm có thể làm ảnh hưởng tới
sức khoẻ người sử dụng thực phẩm đó hoặc làm hư hỏng thực phẩm.
- Bên cạnh các điều tra dịch tễ học thì việc xác định tác nhân gây nên
các vụ ngộ độc thực phẩm là hết sức quan trọng.
2) Cỡ mẫu:
- Thông thường từ 250 – 500g, ít nhất là 100g mẫu.
- Tỷ lệ lượng mẫu lấy trong một lô hàng chiếm khoảng 0,5 - 1‰
3) Dụng cụ dùng để lấy mẫu thực phẩm.
• Dụng cụ lấy mẫu thực phẩm phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Làm bằng vật liệu trung tính, an toàn, vô trùng, không thôi nhiễm các
chất độc hại vào thực phẩm hoặc làm ôi nhiễm thêm.
- Không bị thực phẩm ăn mòn, hư hỏng, dẽ cọ rửa, dễ khử trùng.
- Dụng cụ đựng mẫu phải có dung tích chứa ít nhất 250g hoặc 250 ml
thực phẩm, có nắp đậy kín, tránh rò rỉ ra ngoài.
• Danh mục các dụng cụ thường dùng trong lấy mẫu thực phẩm:
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
3
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Trang thiết bị, dụng cụ Số lượng
Dụng cụ lấy mẫu - Dụng cụ để viết ( bút
bi, bút dạ, bút chì…)
- Nhãn mác dùng cho
mẫu kiểm tra
- Nhiệt kế
- Lượng cần thiết
- Lượng cần thiết
- 01
Dụng cụ phục vụ cho
việc vận chuyển mẫu
kiểm tra
- Bình tích / thùng lạnh
- Túi / đá tích lạnh
- Túi ni lon
- 02
- Lượng cần thiết
- Lượng cần thiết
Dụng cụ dùng lấy mẫu,
chứa mẫu kiểm tra.
- Cồn sát trùng
- Kẹp tiệt trùng
- Kéo tiệt trùng
- Thìa tiệt trùng
- Pipet tiệt trùng
- Túi ni lon vô trùng
- Hộp, lọ miệng rộng,
có nắp đậy, vô trùng để
đựng mẫu
- Dây cao su buộc
- Đèn cồn
- 250ml
- 05 cái
- 02 cái
- 02 cái
- 05 cái
- Lượng cần thiết
- Lượng cần thiết
- Lượng cần thiết
- 02 cái
4) Kỹ thuật lấy mẫu:
- Mỗi loại thực phẩm phải được lấy và chứa đựng trong một dụng cụ vô
trùng riêng biệt.
- Trộn đều từng loại trước khi lấy mẫu.
- Lượng mẫu lấy đúng theo quy định
- Dán nhãn có ghi đầy đủ các thông tin về mẫu như: tên mẫu, ngày lấy
mẫu, tên và địa chỉ của bên yêu cầu kiểm nghiệm, các yêu cầu kiểm
nghiệm, tình trạng khi lấy mẫu.
- Lấy mẫu trong tình trạng không làm tạp nhiễm thêm vào mẫu.
5) Bảo quản và vận chuyển
- Mẫu phải được bảo quản và vận chuyển trong điều kiện không làm
thay đổi số lượng vi khuẩn có trong thực phẩm.
- Mẫu phải được bảo quản trong hộp xốp, bình cách nhiệt có chứa đá
hoặc đá khô trong suốt quá trình vận chuyển. Riêng đối với thực phẩm
khô, đồ hộp không cần bảo quản lạnh.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
4
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
- Mẫu sau khi lấy phải được chuyển ngay về phòng kiểm nghiệm và
bảo quản theo các quy định về lưu giữ mẫu ở phòng kiểm nghiệm.
6) Yêu cầu đối với phòng kiểm nghiệm:
,-./01234  -
- Nhân viên phòng kiểm nghiệm phải kiểm tra trạng thái của mẫu khi tiếp
nhận. Nếu trạng thái không đảm bảo hoặc mẫu không đầy đủ, thông thường
phòng kiểm nghiệm không được nhận mẫu đó. Trong trường hợp đặc biệt
nhân viên phòng kiểm nghiệm có thể phân tích chúng nhưng phải ghi chú lại
tình trạng mẫu khi báo cáo kết quả.
- Ở phòng kiểm nghiệm mẫu thực phẩm phải được tiếp tục bảo quản ở ngay
ở nhiệt độ thích hợp đối với từng loại mẫu.
- Thực phẩm đông lạnh phải được bảo quản ở nhiệt độ <-5
o
C.
- Thực phẩm tươi, thực phẩm chế biến sẵn phải được giữ ở nhiệt độ 0 – 5
o
C.
- Thực phẩm khô, đồ hộp không cần bảo quản lạnh ( chỉ cần bảo quản ở
nhiệt độ phòng).
, &5-
- Để tránh xảy ra tạp nhiễm giữa môi trường và mẫu thử nên tiến hành lấy
mẫu thử trong phòng vô trùng. Các sản phẩm được dự đoán là có rất vi sinh
vật ( ví dụ sản phẩm đã tiệt trùng, món ăn đã nấu ) bao giờ cũng kiểm tra
trước tiên, tiếp theo mới kiểm tra mẫu dự đoán bị nhiễm cao hơn.
- Việc bảo vệ môi trường khỏi bị tạp nhiễm là đặc biệt quan trọng trong quá
trình cân và lấy mẫu thử từ các sản phẩm dạng bột bị nhiễm cao. Các bước
tiến hành này phải thực hiện trong tủ an toàn sinh học.
- Phải lấy mẫu sao cho tránh được bất kỳ lây nhiễm nào. Để đạt được điều
đó phải chú ý như sau:
 Khi không làm việc trong tủ an toàn: tiến hành lấy mẫu trong tầm
ngọn lửa đèn cồn.
 Đối với sản phẩm đã bao gói sẵn: lau sạch bên ngoài bằng cồn sát
khuẩn tại vị trí sẽ mở, nếu có thể thì đốt bằng ngọn lửa.
 Dùng dụng cụ để mở bao gói ( cái mở hộp, mở nút chai, kéo.) dụng cụ
lấy mẫu ( thìa, kẹp, pipet ) phải vô trùng.
 Đánh dấu cẩn thận số ký hiệu của mẫu thử trên vật chứa, túi ni lon
chứa mẫu thử.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
5
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS TRONG THỰC PHẨM
1) Nguyên lý kỹ thuật:
Coliform là những vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc đặc trưng trên
thạch lactoza và lên men đường lactoza và có sinh khí. Phương pháp sử
dụng kỹ thuật đổ đĩa, nuôi cấy một lượng mấu quy định trên môi trường
thạch VRBL ở nhiệt độ 37
o
C trong 24 giờ. Đếm những khuẩn lạc đặc trưng
được khẳng định bằng lên men đường lactoza.
2) Dụng cụ, môi trường, thuốc thử:
67"7-
- Tủ ấm 37
o
C
- Máy đồng nhất mẫu
- Máy đếm khuẩn lạc
- Hộp lồng, pipet vô trùng
- Túi đồng nhất mẫu
- Dụng cụ lấy mẫu: dao, kéo, thìa… vô trùng
- Đèn cồn
- Bông, cồn sát khuẩn, bút viết kính
89&:4;
+ Môi trường chọn lọc: Thạch VRBL ( violet red bile lactose)
 Pepton 7g
 Cao men 3g
 Lactose 10g
 Natri clorua 5g
 Muối mật 1,5g
 Đỏ trung tính 0,03g
 Tím tinh thể 0,002g
 Thạch 15g
 Nước cất vừa đủ 1000ml.
Đun cho tan các thành phần, không đẻ sôi qua lâu hoặc đun quá nhiều lần.
không hấp tiệt trùng trong nồi hấp. pH = 7,4±0,1 ở 25°C.
+ Môi trường khẳng định: canh thang mật lactoza lục sáng BGBL
( Brillian green bile lactose).
Dịch thuỷ phân casein bằng enzyme 10g
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
6
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Lactoza ( C
12
H
22
O
11
.H
2
o) 10g
Mật bò khô 20g
Lục sáng (Brilliant green) 0,0133g
Nước cất 1000 ml
Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng
cách đun nhẹ (nếu cần). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH = 7,2± 0,2 ở
25°C. Chuyển 10 ml môi trường vào từng ống nghiệm chứa ống Durham.
Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121
o
C. Các ống Durham không
được chứa bọt khí sau khi khử trùng.
+ Dung dịch Pepton đệm:
* Pepton 10g
* Natri clorua 5g
* Dinatri hydrophotphat (Na
2
HPO
4
) 9g
* Kali dihydrophotphat (KH
2
PO
4
) 1,5g
* Nước cất vừa đủ 1000 ml
Tiệt trùng ở 121
o
C trong 15 phút. pH = 7,0± 0,2 ở 25°C.
3) Cách tiến hành:
<=&203> - Cân 25g mẫu trong điều kiện vô trùng,
cho vào túi đựng mẫu vô trùng. Cho thêm 225 ml dung dịch Pepton đệm.
Nghiền mẫu bằng máy nghiền Stomacher trong 1 phút. Thu được dung dịch
mẫu thử 10
-1
. Tiếp tục pha loãng để thu được dung dịch mẫu thử 10
-2
, 10
-3
,
10
-4

<? 9"-
- Với mỗi mẫu phải nuôi cấy ít nhất ở 2 độ pha loãng liên tiếp. Việc quyết
định nuôi cấy ở độ pha loãng nào tuỳ thuộc mức độ nhiễm bẩn dự kiến của
mẫu sao cho không quá 150 khuẩn lạc trong mỗi đĩa. Mỗi độ pha loãng nuôi
cấy 2 đĩa. Phải dùng pipet riêng cho mỗi độ pha loãng và thời gian từ khi
pha loãng mẫu đến khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.
- Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dung dịch mẫu thử 10
-2
cho vào 2 đĩa petri vô
trùng. Dùng một pipét vô trùng khác hút 1ml dung dịch mẫu 10
-3
cho vào 2
đĩa petri khác.
- Thạch VRBL đun tan chảy để nguội khoảng 45±0,5
o
C, rót vào mỗi đĩa 15
ml thạch, lắc trộn đều mẫu và môi trường. Để đông ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm trên mặt phẳng ngang. Rót tiếp 4 ml thạch VRBL lên lớp thạch đã
đông, láng đều mặt.
- Đổ một đĩa để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường VRBL và thao tác
tương tự nhưng không có dịch cấy.
- Ủ trong tủ ấm 37
o
C trong 24-48 giờ.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
7
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
<</"@" A3B"2CD'-
- Sau thời gian nuôi cấy, nếu có thể, chọn các đĩa petri có từ 10 đến 150
khuẩn lạc, đếm các khuẩn lạc có màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5mm
hoặc lớn hơn ( đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh). Các khuẩn
lạc này được coi là các coliforms điển hình và không cần phải thử
khẳng định.
- Đếm và khẳng định các khuẩn lạc điển hình có kích cở nhỏ hơn và tất
cả các khuẩn lạc có nguồn gốc từ các sản phẩm sữa và có chứa đường
không phải là đường lactoza. Việc chuyển hoá đường không phải là
đường lactoza có thể làm cho khuẩn lạc có hình dạng nhìn tương tự
như coliform điển hình.
- Khẳng định: cấy 5 khuẩn lạc của từng loại không điển hình vào các
ống BGBL. Ủ các ống nghiệm này trong tủ ấm 37
o
C trong 24h±2h.
Các ống Durham cho thấy có sinh khí thì dược coi là có chứa
coliform.
4) Đọc kết quả:
Tính số lượng coliform trong 1g hoặc trong 1ml sản phẩm theo công thức
sau:

EF
G
?
)21( +
=

Trong đó:
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa
V: thể tích dung dịch mẫu cho vào mỗi đĩa petri
n
1
: số đĩa được giữ lại để đếm ở nồng độ thứ nhất
n
2
: số đĩa được giữ lại để đếm ở nồng độ thứ hai
d: hệ số pha loãng thấp nhất được sử dụng
* Làm tròn kết quả tính được tới số hàng trăm và biểu thị kết quả theo biểu
thức: .10
H
Trong đó: n: số thập phân tương ứng từ 1,0 đến 9,9.
x: số mũ phù hợp của 10
- Nếu cả hai đĩa chứa huyền phù ban đầu (ứng với độ pha loãng 10
-1
)
đều chứa ít hơn 15 khuẩn lạc, lấy trung bình số học của chúng và khi
đó kết quả được tính:
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
8
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp

E
H
1

= 10m vi khuẩn hiếu khí/g
(d là hệ số pha loãng của dịch huyền phù ban đầu, bằng 10
-1
)
Ví dụ:
mẫu Sữa: - Ở nồng độ 10
-1
đếm được 1 đĩa có 143 khuẩn lạc
- Ở nồng độ 10
2
đếm được 1 đĩa có 12 khuẩn lạc.
Áp dụng công thức ta có:
Số lượng Colirorm trong 1ml là:

EF
G
?
)21( +
=


1
10).11(.1
155

+
=
?
N= 140,9 x 10
1
= 1,409 x 10
3
KL/1ml.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
9
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ E.COLI TRONG THỰC PHẨM
A. Kỹ thuật xác định tổng số E. coli trong thực phẩm.
1. Nguyên lý kỹ thuật.
Định lượng E.coli dựa trên nguyên lý: vi khuẩn E.coli là những vi khuẩn
lên men lactoza, sinh hơi và sinh Indol từ tryptophan ở 44
o
C.
2. Dụng cụ, môi trường và thuốc thử.
67"7-
- Tủ ấm 37
o
C, 44,5
o
C
- Máy đồng nhất mẫu
- Túi đồng nhất mẫu
- Máy đếm khuẩn lạc
- Hộp lồng, pipet vô trùng
- Dụng cụ lấy mâu: dao, kéo, tthìa vô trùng
- Đèn cồn
- Bông, cồn sát khuẩn, viết dạ kính.
G A$'9&:4;-
2.1 9&:4;&IJ"K3K"-G&&:0&J(3 :3J 3L&.
Thành phần a) Môi trường nồng độ
kép
b) Môi trường nông độ
đơn
Dịch thuỷ phân protein
sữa và protein động vật
bằng enzym
40g 20g
Lactoza(C
12
H
22
O
11
.H
2
o) 10g 5g
K
2
HPO
4
5,5g 2,75g
KH
2
PO
4
5,5g 2,75g
NaCl 10g 5g
Natri lauryl sulfat 0,2g 0,1g
Nước 1000 ml 1000 ml
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
10
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước
bằng cách đun nóng nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH bằng
6,8± 0,2 ở 25
o
C, nếu cần.
Phân phối từng lượng 9ml môi trường này vào các ống nghiệm có kích
thước 16 mm x 160 mm chứa các ống Durham đối với môi trường nồng độ
đơn là 10 ml vào các ống thử có kích thước 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x
200 mm chứa các ống Durham với môi trường nồng độ kép. Khử trùng 15
phút trong nồi áp lực ở nhiệt độ 121
o
C.
 89&:4;"K3K"-G&MG
Dịch thuỷ phân casein bằng enzyme 20,0g
Lactoza (C
12
H
22
O
11
.H
2
o) 5,0g
Muối mật (bile salts) 1,5g
K
2
HPO
4
4,0g
KH
2
PO
4
1,5g
NaCl 5,0g
Nước 1000 ml
Hoà tan các thành phần hoá học hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong
nước bằng cách đun nóng nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH
= 6,8± 0,2 ở 25
o
C, nếu cần.
Phân phối từng lượng 10ml môi trường này vào các ống nghiệm có
kích thước 16 mm x 160 mm chứa các ống Durham. Khử trùng 15 phút
trong nồi áp lực ở nhiệt độ 121
o
C.
< ?4"0(0&#9"NOE3
Dịch thuỷ phân casein bằng Enzyme 10,0g
Natri clorua 5,0g
Nước 1000 ml
Hoà tan các thành phần hoá học hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong
nước bằng cách đun nóng nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH
bằng 7,3± 0,2 ở 25
o
C, nếu cần.
Phân phối từng lượng 10ml môi trường này vào các ống nghiệm có kích
thước 16 mm x 160 mm. Khử trùng 15 phút trong nồi áp lực ở nhiệt độ
121
o
C.
 6 E"DP0(0&
Pepton 10g
NaCl 5g
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
11
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
K
2
HPO
4
9g
KH
2
PO
4
1,5g
Nước 1000ml
Hấp tiệt trùng ở 121
o
C trong 15 phút. pH = 7,0 ± 0,2 ở 25
o
C.
3. Cách tiến hành.
3.1 =&203> - Cân 25g mẫu trong điều kiện vô trùng,
cho vào túi đựng mẫu vô trùng. Cho thêm 225 ml dung dịch Pepton đệm.
Nghiền mẫu bằng máy nghiền Stomacher trong 1 phút. Thu được dung dịch
mẫu thử 10
-1
. Tiếp tục pha loãng để thu được dung dịch mẫu thử 10
-2
, 10
-3
,
10
-4

việc quyết định nuôi cấy ở độ pha loãng nào tuỳ thuộc mức độ nhiễm bẩn dự
kiến của mẫu.Phải dùng pipet riêng cho mỗi độ pha loãng và thời gian từ khi
pha loãng mẫu đến khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.
<? 9G-
- Dùng pipep vô khuẩn chuyển vào bộ 3 ống nghiệm chứa canh thang
tryptoza lauryl sulfat lỏng nồng độ kép 10ml mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu
là chất lỏng hoặc 10 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
- Dùng pipep vô trùng chuyển vào 3 ống canh thang tryptoza lauryl sulfat
nồng độ đơn 1ml mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc 1 ml
huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.
- Đối với độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như mô tả ở trên. Sử dụng mỗi
pipet vô trùng cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.
- Nuôi cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37
o
C trong 24h±2h. Nếu ở giai đoạn này
không sinh khí cũng như không bị mờ đục làm cản trở việc quan sát sự sinh
khí thì ủ tiếp đến 48h± 2h.
- Từ các ống đã ủ ấm có biểu hiện sinh khí hoặc đục mờ, cấy truyền một
vòng cấy sang ống nghiệm đựng canh thang EC. Ủ các ống nghiệm ở nhiệt
độ 44
o
C trong 24h±2h. Nếu giai đoạn này không thấy sinh khí trong canh
thang EC thì kéo dài thời gian ủ đến 48h± 2h.
- Nếu quan sát thấy sinh khí ở canh thang EC, thì cấy chuyển một vòng dịch
cấy vào nước pepton ( đã được làm ấm đến 44
o
C), ủ ở 44
o
C trong 48h.
- Kiểm tra sự sinh Indol bằng cách thêm 0,5 ml thuốc thử Kovacs vào các
ống chứa pepton, trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu trong pha cồn có màu
đỏ, chứng tỏ có Indol.
4. Tính kết quả.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
12
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Đếm toàn bộ số ống canh thang nuôi cấy dương tính, tra bảng MPN 3
hàng ống tính ra số vi khuẩn có trong 1ml/ 1g thực phẩm.
Thí dụ lựa chọn các kết quả dương tính đối với việc tính toán MPN:
Mẫu Số ống dương tính nhận được từ 3 ống
được ủ ấm đối với số mẫu được nuôi cấy
trên ống
MPN

Sp lỏng 10ml 1ml 10
-1
ml 10
-2
ml
10
-3
ml
Các SP khác 1g 10
-1
g 10
-2
g 10
-3
g
10
-4
g
Sản phẩm
lỏng
Các dạng
sản phẩm
khác
1
2
3
4
3 3 3 0

2 2 1 1 0
3 3 0 0 0
2 2 0 1 0
2,4
2,4. 10
2
7
7. 10
1
2,4
2,4. 10
1
2,1 . 10
-1

2,1
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
13
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
   
II. Vi Sinh Nước:
Xét nghiệm Coliform, E.coli trong nước
PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU NƯỚC ĐỂ XÉT NGHIỆM
VI SINH
1) Chuẩn bị lấy mẫu nước
G A$'E7"7 :
- Chai cồn có bấc / đèn cồn 90
o
C 01 cái
- Diêm / bật lữa : 01 cái
- Chai thuỷ tinh hoặc chai nhựa có nút 200ml-1000ml tuỳ nhu cầu
- Dụng cụ lấy nước sông / quang lấy mẫu 01 cái
- Kẹp / pince 01 cái
- Thùng cách nhiệt đựng đá: 01 cái
- Nhãn, bút viết trên thuỷ tinh 01 cái
Yêu cầu 1: Dụng cụ lấy nước phải vô khuẩn.
Chai lấy mẫu là chai thuỷ tinh trung tính, chịu được nhiệt độ cao khi khử
trùng, dung tích từ 300-1000ml, có miệng rộng, chiều cao của chai trên 15
cm. chai lấy mẫu phải được ngâm hoá chất khử khuẩn rồi súc rửa sạch, súc
rửa lần cuối cùng với nước cất, để khô ráo, khử khuẩn ở nhiệt độ 121
o
C/15
phút.
Nút chai là bông không thấm nước hoặc nút mài thuỷ tinh văn vừa khít,
hoặc nút nhựa, bên ngoài được bọc bởi một lớp giấy bạc không thấm nước.
tất cả các chai và nút chai cần được hấp và sấy vô khuẩn chỉ trong vòng 2
tuần trước khi lấy mẫu.
Q5"3E4&:4"
Yêu cầu 2: khử clo dư trong nước để loại trừ khẳ năng vi khuẩn tiếp tục bị
tiêu diệt.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
14
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Nước được khử trùng bằng các hợp chất Clo, lượng clo có thể tồn lưu
trong nước sau khi lấy mẫu. Lượng Clo dư này sẽ tiếp tục tác động lên
những vi khuẩn còn sống trong mẫu nước làm cho kết quả xét nghiệm vi
sinh sau này không thể hiện chính xác số lượng vi khuẩn còn sống va tồn tại
trong mẫu nước vào thời điểm lấy mẫu. Muốn phát hiện số vi khuẩn còn
sống tại thời điểm lấy mẫu, cần cho thêm Natri thiosulfit (Na
2
S
2
O
3
)
để khử clo dư trong nước.
Thêm (Na
2
S
2
O
3
) vào chai định lấy mẫu nước có clo dư, trừ khi chai
đựng mẫu có chứa sẵn môi trường nuôi cấy vi khuẩn thì không cho thêm
(Na
2
S
2
O
3
).
Thêm đủ (Na
2
S
2
O
3
) vào chai đã được khử khuẩn để có được nồng độ
100 mg/l trong mẫu nước. Đối với chai có dung tích trên 120ml thì thêm
10ml 10% (Na
2
S
2
O
3
) ( cho phép trung hoà một mẫu chứa khoảng 15 mg/l
clo dư.).
Cần dán nhãn lên chai mẫu để biết đã cho (Na
2
S
2
O
3
).
Riêng đối với các mẫu nước có chứa nồng độ cao kẽm hoặc đồng, các
mẫu nước thải có chứa kim loại nặng cao thì dùng chất gắn đặc hiệu để
trung hoà chúng. Nhất là đối với các mẫu nước được vận chuyển trong thời
gian quá 4 tiếng đồng hồ, việc trung hoà rất cần.
2) Kỹ thuật lấy mẫu nước về vi sinh
G@"&N"3R& 4"-
Lấy mẫu vào chai và chừa ít nhất 2,5 cm chiều cao của chai để dễ lắc trộn
mẫu sau này. Dù bất cứ loại nước nào, cách lấy mẫu cũng như nhau, nghĩa là
phải tuyệt đối vô khuẩn. Cách lấy mẫu liên quan tới kết quả kiểm nghiệm
sau này.
4"!
Trước khi lấy mẫu phải dùng khăn lau sạch chất bẩn bám vào đầu vòi
nước, đốt vòi bằng ngọn lữa đèn cồn trong 1 phút. Mở vòi, để cho nước chảy
2-3 phút để làm sạch đường ống. mở giấy bọc chai thuỷ tinh, dùng kẹp/
pince rút nút bông hoặc nút thuỷ tinh, hơ miệng chai trên ngọn lữa đèn cồn
va hứng nước chảy vào chai. Không để nước bắn tung toé khi lấy nước vòi.
Lấy đủ nước xong lập tức hơ miệng chai trên ngọn lữa đèn cồn, đậy nút
ngay.
<4"#=#J9J S
Tuỳ theo mục đích mà vị trí lấy mẫu và số lượng mẫu cần lấy được quy
định khác nhau. Để đánh giá chất lượng nước dùng làm nguồn cung cấp cho
trạm xử lý nước sinh hoạt người ta có thể phải lấy nhiều mẫu trên nhiều mặt
cắt khác nhau của ao, hồ.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
15
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Trong trường hợp chỉ lấy một mẫu đại diện thì ta chọn vị trí lấy mẫu như
sau:
- Nước ao hồ: Giữa ao hồ
- Sông suối: Giữa dòng chảy của sông.
Chiều sâu lấy mẫu bằng ½ chiều sâu lớp nước tại nơi đó nhưng phải cách
mặt nước ít nhất 30cm để tránh ảnh hưởng diệt khuẩn do ánh sáng mặt trời.
Để lấy mẫu nước sông, hồ ta dùng dụng cụ lấy mẫu nước gọilà quang lấy
mẫu. trước hết khử khuẩn quang bằng ngọn lửa đèn cồn, lắp chai lấy mẫu
vào.
Dùng kẹp / pince rút nút bông hoặc nuts thuỷ tinh, hơ miệng chai trên
ngọn lửa đèn cồn rồi thả nhanh xuống nước đến độ sâu cần thiết. khi nước
vào đầy chai, kéo quang lên, đổ bớt nước trong chai rồi hơ miệng chai trên
ngọn lữa đèn cồn, đậy nút ngay.
?4"/D2#4"&:$T"N9"U!
Mẫu nước được lấy giữa giếng, bể. thao tác lấy mẫu giống như nước sông.
3) Thể tích mẫu nước
Yêu cầu 4 :
Lấy nước đủ cho xét nghiệm va lưu trữ, không lấy đầy dễ làm nhiễm
mẫu nước. Nếu xét nghiệm 3 chỉ tiêu, cần 100ml nước cho 1 chỉ tiêu thì nên
lấy trên 600ml, trrong đó:
- 300ml để xét nghiệm lần thứ nhất.
- Lượng nước còn lại đủ để xét nghiệm lần 2, hoặc lần 3.
<V>W"4"
Yêu cầu 5: Mỗi mẫu nước gửi đi kiểm nghiệm phải có nhãn ghi đầy đủ.
Gồm:
- Tên đơn vị, cá nhân gửi mẫu
- Địa điểm lấy nước
- Loại nước ( nước bề mặt, nước giếng, nước máy, nước lọc qua
bình…)
- Ngày giờ, tháng, năm lấy nước ( phải ghi giờ)
- Yêu cầu xét nghiệm vi sinh ( từng chỉ điểm cụ thể)
- Mục đích xét nghiệm ( dùng cho ăn uống, sinh hoạt, kỹ thuật)
- Tên người lấy mẫu nước.
- Cách thức bảo quản mẫu
<X) 2"& 
Yêu cầu 6: Lưu mẫu đảm bảo số lượng vi khuẩn trong nước không
thay đổi.
Bắt đầu xét nghiệm vi sinh một mẫu nước ngay lập tức sau khi thu thập
mẫu, tránh những thay đổi về số lượng vi sinh vật.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
16
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
Nếu chưa thể xét nghiệm ngay, nên bảo quản mẫu trong thùng lạnh, túi
nước đá ở 2-4
o
C trong suốt qua trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm. Nếu
không có nước đá để bảo quản thì phải gửi về phòng thí nghiệm trong vòng
1 giờ sau khi lấy nước. Giữ lạnh mẫu nước trong phòng thí nghiệm trong
vòng không quá 24 giờ.
XÁC ĐỊNH COLIFORM TỔNG SỐ, COLIFORM CHỊU NHIỆT,
ESCHERICHIA COLI
Phương pháp lên men nhiều ống – Phương pháp MPN
1) Nguyên lý
1.1. Khái niệm về phương pháp lên men nhiều ống.
Do vi khuẩn không phân tán đều trong nước, cho nên trong cùng một thể
tích nước, số lượng vi khuẩn tronh những thể tích đó thường khác nhau.
Giả sử trong 1000ml nước có 10.000 vi khuẩn A, khi lấy 1ml từ mẫu
nước này, không chắc chắn trong đó đã có 10 vi khuẩn A mà có thể có nhiều
hơn hoặc ít hơn 10. Do v
B ậy, nếu định lượng vi khuẩn (đếm vi khuẩn ) từ một thể tích nước nhất
định lấy ra từ mẫu rồi nhân lên với hệ số pha loãng để có kết quả vi khuẩn
trong 100ml hoặc 1000 ml mẫu thì ta sẽ mắc sai lầm, do sự phân tán không
đồng đều của vi khuẩn trong mẫu gây nên.
Để giảm thiểu sự sai lệnh này, người ta áp dụng phương pháp xác suất
thống kê kết hợp với kỹ thuật vi sinh vật học để định lượng vi khuẩn. Theo
đó, người ta nuôi cấy vi khuẩn trong nhiều ống môi trường với nhiều lượng
thử thập phân khác nhau. Dựa vào số ống dương tính trong mỗi bậc pha
loãng, tra vào bảng thống kê tính sẵn, người ta sẽ tính được số lượng vi
khuẩn có trong 100ml nước thử. Một phối hợp gồm 3 hàng ống ( 3 bậc nồng
độ), mỗi hàng 5 ống là phối hợp thường được dùng nhất.
Phương pháp này, do vậy được gọi là Y4Z0@03([ S.
Phương pháp này thường được gọi tắt là 04Z0@08Y? ( the Most
Probable Number ) do kết quả tìm được từ bảng thống kê là "JS"U3\
D%& về số lượng vi khuẩn có trong 100ml thể tích mẫu.
1.2. Nguyên lý của thử nghiệm coliform tổng số, coliform chịu nhiệt,
E.coli:
Dựa trên đặc tính của nhóm Coliform là có khả năng lên men đường
lactose, tạo ra sản phẩm hoá học trung gian là aldehyt, axit và sinh hơi ở 35-
37
0
C trong vòng 24-448 giờ, người ta tăng sinh mẫu nước vào ống canh
thang CLP, có chứa lactose và chỉ thị đỏ phenol với 1 phao Durham. Sau khi
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
17
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, ống canh thang nào có Coliform sẽ lên
men lactose, sinh axit làm canh thang từ màu đỏ (PH=7-7,4) sẽ chuyển sang
màu vàng (PH=6,8); đồng thời, coliform sinh hơi được giữ lại trong ống
Durham (úp ngược). những ống chuyển màu như vậy, được đọc là ống
dương tính sơ bộ.
Để khẳng định, người ta dựa vào tính chất sinh aldehyt của coliform bằng
cách lấy các ống CLP dương tính trên thạch EMB hoặc ENDO chứa hợp
chất fuchsin – sulfite. Aldehyt sinh ra sẽ kết hợp với sulfite và giải phóng
fuchsin trên mặt thạch, thạch có màu hồng đỏ và ánh kim.
Để xác định coliform chịu nhiệu, ta cũng làm như trên, nhưng dùng nhiệt
độ ủ là 44,5 ± 0,2
0
C.
2. Dụng cụ môi trường
67"7-
- Pipet 1-2ml: ít nhất 2 cái, tuỳ số lượng vi khuẩn có trong 1ml nước mà
số pipet sẽ tăng lên.
- Pipet 5 ml : 2 cái
- Pipet 10 ml hoặc 20 ml hoặc 25 ml : 1 cái
- Ống nghiệm 18x180
mm
chứa 10 ml canh thang lactose đậm đặc, có ống
Durham : 10
- Ống nghiệm 16x 160
mm
chứa 5-10 ml canh thang lactose loãng, có ống
Durham: 20
- Ống nghiệm 16x 160
mm
chứa đúng 9ml NaCl 9‰, nếu chưa đủ 9ml phải
thêm đủ.
- Đĩa Petri d = 75 hoặc 90 mm : 2 -4 cái.
Các dụng cụ trên đã được hấp sấy vô khuẩn.
- Giá inox
- Bút viết kính : 1 cái
- Kẹp / pince : 1 cái
- Bóp cao su : 1 cái
- Đen cồn : 1 cái
- Tủ ấm 37
0
C và 44,5
0
C.
89&:4;E]" +
- Nước muối sinh lý (Nacl 9‰), chỉnh dung 9ml/ ống nghiệm 18: 1 ống
- Ống CLP ( canh thang latose có chỉ thị màu đỏ phenol), pH = 7,2 – 7,4 và
phao Durham.
Có 2 loại:
• Canh thang đâm đặc ( gấp 2 lần bình thường) ; 5 ống
• Canh thang loãng ( bằng 1 lần bình thường) : 10 ống.
- Thạch ENDO hoặc thạch EMB đỗ sẵn ra đĩa: 2 đĩa d = 75 – 90 mm.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
18
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
2. Quy trình
2 .1. Coliform tổng số:
2.1.1. Thử nghiệm đối với nước sạch.
* Test sơ bộ:
- Sắp vào một giá gồm 3 hàng: 5 ống CLP đậm đặc thành một hàng, 10 ống
CLP loãng thành 2 hàng, cạnh hang thứ 2, đặt 1 ống NaCl 9‰ 9 ml.
- Lắc đều chai mẫu. Rút giấy bọc các ống nghiệm, dùng kẹp rút 2/3 nút
bông.
- Dùng pipet 10ml vô khuẩn hút 10 ml nước ban đầu cho vào mỗi ống CLP
đậm đặc.
- Dùng pipet 5ml vô khuẩn lấy 1 ml nước ban đầu cho vào ống nghiệm CLP
loãng ở hàng thứ 2.
- Tiếp tục cho 1ml nước ban đầu cho vào ống NaCl 9‰ 9 ml để có lượng
thử 1/10 ( 10
-1
).
- Dùng pipet 5 ml khác trộn đều và hút 1ml nước 1/10ml cho vào mỗi ống
CLP loãng ở hàng thứ 3.
Một phối hợp lượng thử như trên được gọi là phối hợp 10-1-0,1 hoặc 10
– 1 – 10
-1
.
- Cầm giá ống nghiệm lắc đều. cho vào tủ ấm 37
o
C và ủ trong 48 ± 3
giờ.
K"/&) "^&(J&JZ$R- sau khi ủ những ống canh thang CLP chuyển
màu vàng và có bọt khí trong phao thì được ghi nhận là dương tính ở bước
thử sơ bộ.
* Test khẳng định:
- Dùng bút viết kính kẻ trên mặt đáy đĩa thạch EMB hoặc ENDO một số ô
ứng với số ống CLP dương tính sơ bộ, ghi thông tin về lượng thử các ô,
thông tin về mẫu, ngay giờ cấy.
- Dùng que cấy, cấy ria từng que cấy riêng biệt từ mỗi ống canh thang dương
tính của test sơ bộ vào mỗi ô kẻ sẵn ứng với lượng thử đã ghi trên đó.
- Đặt úp các đĩa thạch vào tủ ấm 37
o
C/24 giờ.
K"/&) CD'-
Các ô nào xuất hiện khuẩn lạc màu hồng đỏ, có ánh kim được ghi nhận lầ
ô dương tính với Coliform. Đếm số ô dương tính ở các lượng thử và ghi lại.
Ví dụ - hàng 10 ml mẫu có 5 ô dương tính, hàng 1ml mẫu có 3 ô dương tính,
hàng 10
-1
có 1 ô dương tính, ta sẽ ghi nhận kết quả là 5-3-1.
• Tra bảng MPN.
Tra bảng MPN ứng với phối hợp 3 hàng ống mỗi hàng 5 ống ta được kết quả
bằng 110. vậy, kết quả coliform tổng số ( đơn vị tính là MPN/100ml) là :
110/100ml.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
19
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
2.1.2. Thử nghiệm đối với nước bẩn.
Đối với những mẫu nước bẩn hơn nếu dùng phối hợp lượng thử như
trên có thể sẽ dẫn đến kết quả 15 ống thử đều dương tính. Khhi tra bảng
MPN, kết quả của phối hợp trên sẽ là 5-5-5 cho ta giá trị coliform/100ml sẽ
> 2.400 mà không biết được con số chính xác hơn của coliform.
Muốn có kết quả rõ ràng hơn, ta cần phải dùng phối hợp các lượng thử
nhỏ hơn.
Ví dụ :
Trường hợp 1 : 1 – 0,1 – 0,01ml hay viết là: 1 – 10
-1
– 10
-2
.
Trường hợp 2 : 0,1 – 0,01 – 0,001ml hay viết là 10
-1
– 10
-2
– 10
-3
.
Trường hợp 3: 0,01 – 0,001 – 0,0001ml hay viết 10
-2
- 10
-3
– 10
-4
.
Còn có thể pha loãng hơn nữa. nước càng bẩn càng phải pha loãng nhiều
hơn nữa.
Trong thực hành, để có lượng thử 0,01ml (10
-2
) ta dùng pipet vô khuẩn
hút lấy 1ml nước thử đã pha loãng 10
-1
rồi cho vào ống chứa 9ml nước muối
9‰ và hút trộn đều. dùng pipet khác, lấy 1ml dung dịch này cho vào mỗi
ống của hàng ống có lượng thử 0,001 (hay 10
-2
).
Làm tương tự cho các bậc pha loãng khác.
Vì không dùng đen lượng thử 10ml nên 15 ống CLP được sử dụng đều là
CLP loãng.
Các bước thử nghiệm sơ bộ và khẳng định đều làm giống như mục
2.1.1
Khi tính kết quả, nếu pha loãng mẫu đi bao nhiêu lần, phải nhớ nhân
lên bấy nhiêu lần tuỳ theo mức pha loãng đã thực hiện so với mức cơ bản
(10-1-10
-1
).
Ví dụ: đã dùng phồi hợp lượng thử: 0,1 - 0,01- 0,001ml (10
-1
– 10
-2

10
-3
) và kết quả số ống dương tính là 5 – 3 – 1. Sauk hi tra bảng MPN được
giá trị 110, để có kết quả về độ đậm của Coliform /100ml ta phải nhân với
100.
Vậy, kết quả Coliform tổng số (MPN/100ml) sẽ là: 11.000
(hay 11 x 10
3
).
2 .2. Coliform chịu nhiệt
Để định lượng Coliform chiuh nhiệt ta thực hiện quy trình giống như đã
trình bày trong phần Coliform tổng số B&:_&:$4"&(J&JZ$RP&
DR^J\32#`#;
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
20
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
ESCHERICHIA COLI
E.coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân phát triển được ở
44±0,2
o
C ( một số chủng có thể phát triển ở 37
o
C chứ không phát triển ở
44±0,2
o
C), lên men đường lactose, sinh indol từ tryptophan, sinh hơi và acid
( có một số chủng không sinh hơi ), phản ứng Oxydase và Urea âm tính.
không sinh aceoin và không dùng citrate làm nguồn carbon duy nhất.
Nguyên tắc: E.coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi
ở 44±0.2
o
C

và có kết quả nghiệm pháp IMVIC phù hợp.
1. Vật liệu
- Pipette khắc vạch 10 ml – 1 ml vô trùng
- Que cấy, đèn cồn
- Nước muối sinh lý 9‰ đóng ống 9 ml vô trùng
- Canh thang Lactose loãng đóng ống có ống sinh hơi.
- Canh thang BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%)
- Thaïch EMB Agar
2. Môi trường nuôi cấy:
+ Canh thang lactose broth (g.l-)
Nước chiết thịt 3g
Bacto pepton 5g
Lactose 5g
Nước cất 1000ml
pH 6.9
+ Môi trường tăng sinh: BGBL (g.l-)
Pepton 10g
Lactose 10g
Mật bò 20g
Vebrilliant green 0.0133g
pH 7.2
+ Môi trường EMB Agar (g.l-)
Bacto pepton 10g
Lactose 10g
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
21
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
K2HPO4 2g
Agar 13.5g
Saccarose 5g
Eurin 0.4g
Methylen Blue 0.065g
Nước cất 1000ml
pH 7.1
3) Cách Tiến Hành
* Test sơ bộ:
- Sắp vào một giá gồm 3 hàng: 5 ống CLP đậm đặc thành một hàng, 10 ống
CLP loãng thành 2 hàng, cạnh hang thứ 2, đặt 1 ống NaCl 9‰ 9 ml.
- Lắc đều chai mẫu. Rút giấy bọc các ống nghiệm, dùng kẹp rút 2/3 nút
bông.
- Dùng pipet 10ml vô khuẩn hút 10 ml nước ban đầu cho vào mỗi ống CLP
đậm đặc.
- Dùng pipet 5ml vô khuẩn lấy 1 ml nước ban đầu cho vào ống nghiệm CLP
loãng ở hàng thứ 2.
- Tiếp tục cho 1ml nước ban đầu cho vào ống NaCl 9‰ 9 ml để có lượng
thử 1/10 ( 10
-1
).
- Dùng pipet 5 ml khác trộn đều và hút 1ml nước 1/10ml cho vào mỗi ống
CLP loãng ở hàng thứ 3.
Một phối hợp lượng thử như trên được gọi là phối hợp 10-1-0,1 hoặc 10
– 1 – 10
-1
.
- Cầm giá ống nghiệm lắc đều. cho vào tủ ấm 37
o
C và ủ trong 24 - 48 giờ.
K"/&) "^&(J&JZ$R- sau khi ủ những ống canh thang CLP chuyển
màu vàng và có bọt khí trong phao thì được ghi nhận là dương tính ở bước
thử sơ bộ.
- Dùng que cấy cấy chuyển các ống dương tính vào môi trường canh thang
BGBL có phao Durham.
- Để tủ ấm 37
o
C trong 24-48h
K"/&) : Những ống dương tính là những ống làm đục môi trường, sinh
hơi trong phao.
* Test khẳng định:
- Cấy chuyển các ống dương tính vào môi trường chứa lactose đặc hiệu như
thạcch EMB, ENDO, Chromocul, trên môi trường thạch đặc hiệu, kẻ các
ô ghi các lượng thử tương ứng với các ống dương tính, các ống nghi ngờ,
dùng kỹ thuật cấy 3 đường để cấy sao cho có khuẩn lạc rời.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
22
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
- Để tủ ấm 37
o
C trong 24h lấy ra đọc kết quả.
* Đọc kết quả:
- Trên môi trường EMB, ENDO, chọn các khuẩn lạc rời, có ánh kim trên bề
mặt của từng ô để thực hiện phản ứng IMVIC cho mỗi ô đó.
- Trên môi trường Chromocul chon 1-5 khuẩn lạc cố màu tím, xanh trên mỗi
ô, thực hiện phản ứng IMVIC cho mỗi ô đó.
Phản ứng IMVIC:

Vi khuẩn Indol Đỏ Methyl Voges-Proskauer Citrat
MJ"(:" + + - -
a(33 +/- + - -
G&:$"&(:L:( E - + - +
G&:$"&(:
E(:J J
+ + - +
Nhóm Q3($J(33b
M&(:$"&(:
+/- - + +

cV/&) -
- Ghi kết quả theo từng dãy phả ứng IMVIC của mỗi ô: M"3 có phản
ứng OE3d+#De8(&3d+#G&:&2FY&f
- Ghi kết quả của số ô dương tính với M"3 theo 3 lượng thử thập phân
liên tiếp.
- Tra bảng MPN (10 – 1 – 0,1 ): kết quả M"3/100ml
- Nếu có pha loãng, nhớ nhân kết quả với số lần đã pha loãng, kết quả
cuối cùng phải được tính trên 100ml đã được thử nghiệm.
So sánh QCVN 01-2009/BYT đánh giá kết quả kết quả mẫu nước.
   
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
23
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
III. XÉT NGHIỆM VIRUT VIÊM GAN B
'g: Vi rút gây viêm gan là những vi rút có ái tính với tế bào gan,
đây là tế bào đích mà vi rút xâm nhập, nhân lên và gây tổn thương. Tuy có
cùng tế bào đích, nhưng các vi rút viêm gan có cấu trúc, đường xâm nhập,
cơ chế lan truyền khác nhau. Do vậy, đến nay các vi rút viên gan chính được
chia làm 5 loại: A, B, C, D, và E.
Test chẩn đoán nhanh virut Viêm Gan B
1 ) Cách lấy máu:
Tùy theo từng bệnh nhân xét nghiệm mà ta cần lấy số lượng và vị trí khác
nhau, cách lấy máu thông thường :
• @ &gB"-
Thường lấy với số lượng máu nhiều 3 - 5 ml/lần. Dùng để làm các xét
nghiệm sinh hóa máu, nuôi cấy phân lập tìm vi khuẩn gây bệnh, xét nghiệm
máu tổng hợp…
- G A$'E7"7-
+ Dây ga rô
+ Bơm kim tiêm
+ Cồn sát khuẩn 70
0
+ Bông
+ Pank có mấu
+ Týp đựng mẫu có hoặc không có chất chống đông.
• G@"$4"&/2-
1.1Nơi chọc lấy mẫu
Tĩnh mạch nếp gấp khuỷu tay nơi rỏ nhất và nổi nhất, nên chọc vào một
trong những nhánh của chữ Y, hơi cao hơn điểm nối tiếp nếu cần,… bằng
cách dặt garro phía trên cổ tay.
1.2Chuẩn bị bơm kim tiêm và dụng cụ đựng mẫu
Ghi nhãn mẫu xét nghiệm: số xét nghiệm, tên bệnh nhân, hoặc dán mã số
xét nghiệm ( đã in sẵn) vào mẫu xét nghiệm của bênh nhân.
Xé vỏ bơm kim tiêm, kéo pittong vài lần để kiểm tra bơm tiêm, đồng
thời để dễ lấy máu.
Lấy máu tĩnh mạch bằng bơm kim tiêm sử dụng một lần:
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
24
B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiÖp
- Sát trùng nơi lấy mẫu bằng miếng bông thấm cồn 70
0
.
- Dùng ngón tay trỏ tìm điểm chính xác để chọc. Nếu khó xác định có
thể nói bệnh nhân gập tay lên xuống vài lần để nỗi tĩnh mạch lên ).
* Lưu ý.
Nếu khó xác định điểm lấy máu cần tháo dây garro rồi cột lại, tránh bị
đông máu.
Sát trùng lần thứ 2 với bông thấm cồn 70
0
.
Cầm bơm kim tiêm trong bàn tay phải, ngón trỏ bàn tay phải tỳ vào đốc kim.
Đặt kim đúng vào hướng của tĩnh mạch, đầu vát của kim hướng lên trên.
Chú ý:
Không bao giờ tiếp xúc với tĩnh mạch từ phía cạnh, không bao giờ chọc
với đầu vát của mũi kim quay xuống dưới.
Kim tiêm được đặt ở tư thế hơi hướng lên trên một góc 20
0
so với cánh
tay. Tỳ chắc ngón trỏ vào đốc kim và chọc kim vào giữa tĩnh mạch bằng một
động tác thật là nhanh, không ngập ngừng. ( nếu trúng veine sẽ có cảm giác
nặng tay hơn và sẽ thấy máu chảy vào đốc kim.)
Chọc kim vào trong veine khoảng 1-1,5 cm đồng thời hạ thấp kim so với
cánh tay.
Bằng cách kéo nhẹ nhàng pittong của bơm kim tiêm, máu sẽ vào bơm
tiêm. Tiếp tục rút từ từ pittong để lấy đủ số lượng máu cần cho xét nghiệm.
Đặt miếng bông tẩm cồn lên chỗ chọc kim. Rút kim từ dưới miềng bông
bằng một động rác nhanh.
Nói bệnh nhân giữ nguyên và ấn chặt miếng bông trong 3 phút, không
nên gập cánh tay vì có thể làm hỏng veine.
Lấy kim tiêm ra khỏi bơm tiêm, bơm máu vào tube hoặc lọ đựng máu.
Đậy chặt nắp và lắc trộn lên trộn xuống vài lần. ( nếu mẫu máu toàn phần).
Nếu muốn làm xét nghiệm từ huyết tương ta cho vào tube một lượng chất
chống đông thích hợp với lượng máu đã lấy lắc nhẹ rồi để yên khoảng 30
phút hoặc ly tâm 2000 - 3000 vòng / phút khoảng 5 - 10 phút. Phần dịch phía
trên là huyết tương phần màu đỏ phía dưới là hồng cầu.
Nếu làm xét nghiệm từ huyết thanh thì ta không cho chất chống đông và
không lắc, các bước còn lại tương tự như cách lấy huyết tương.
Hova tên: Võ Thị Quỳnh HươngLp: A25 - 2
25